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fig α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶 对桃果实软化的作用机制研究 导 师： 梁建生 教 授 研究生： 阚 娟 研究意义 研究内容、研究目标以及拟解决的问题 拟采取的研究方法、步骤、技术路线及可 行性分析 本实验的特色与创新之处 实验进度和预期结果 研究基础 研究意义 水蜜桃在盛夏高温季节成熟，果实水分含量高，耐贮藏性较差，采后极易腐烂变质。 水蜜桃是我国特有的名优水果之一，味甜质糯、酸甜适口。 软化是果实发育成熟和采后最明显的质地变化，而且几乎是所有果实的一个特征。 果实的适口性和风味发生变化 达到最理想的使用状态 使果实更容易受到物理伤害和病原侵染，使贮藏寿命缩短 果实软化 桃果实软化特点： 桃是典型呼吸跃变型果实，果实采后迅速进入呼吸高峰期并快速软化，从而使其大规模的商业贮藏极其困难。 桃果实果肉硬度下降发生在两个阶段，在成熟早期，果肉硬度不断下降但很慢；在成熟后期，果肉硬度下降很快，这一阶段也被叫做‘溶质’阶段。 桃果实乙烯释放高峰缓于硬度快速下降期 近年研究发现：果实成熟软化过程中，细胞壁结合型阿拉伯糖和半乳糖基残基的大量减少是细胞壁组成发生的最明显的变化之一 α-AF作为重要的糖苷酶之一，其作用与植物细胞壁果胶、半纤维素多聚体中阿拉伯糖支链的降解密切相关 阿拉伯半乳聚糖 α-AF 探明α-AF基因在果实软化过程中的表达模式 探明α-AF基因与果实内源乙烯积累和细胞壁多糖降解之间的关系 探明C2H4和1-MCP处理对α-AF基因和蛋白质表达的调节机制 研究目标 研究内容 1 对不同成熟度、不同贮藏期以及不同处理的桃，分析果实硬度、可溶性固形物含量、乙烯释放量的变化。分析细胞壁果胶质、半纤维素、纤维素多糖类降解特性（重量的变化、多聚体分子量的变化和单糖类的解离特性）。 2 对不同时期的桃果实材料，分析α-AF基因的表达情况，探讨α-AF基因的表达与果实的软化以及细胞壁半纤维素降解特性之间的关系。 3 使用C2H4和1-MCP处理桃果实，分析果实软化过程中α-AF活性变化以及α-AF、ACC合成酶和ACC氧化酶基因和蛋白质表达水平的变化，研究它们与果实内源乙烯积累的关系以及对α-AF基因和蛋白质表达的调节。 拟解决的关键问题 (1) 如何阻断果实采后初期乙烯与果实体内乙烯 受体的正常结合，抑制乙烯所诱导的与果实后熟衰老相关的一系列生理生化反应。这一点是本研究为说明α-AF对桃果实软化调控机理的前提。 (2) 桃果实组织总RNA的提取纯化和通过RT-PCR方法对该基因的克隆和测序以及该基因在不同时期的表达分析是从分子水平探明α-AF对桃果实软化调控机理的关键。 研究方法 成熟度Ⅰ：盛花后55天，表示2–3成熟，果皮颜色 青绿，基部很硬； 成熟度Ⅱ：盛花后65天，表示4–5成熟，果皮颜色青绿，基部较硬； 成熟度Ⅲ：盛花后70天，表示5–6成熟，果皮颜色青绿微黄，基部微软； 成熟度Ⅳ：盛花后75天，表示7–8成熟，果皮颜色微青带黄，基部较软； 成熟度Ⅴ：盛花后80天，表示9–10成熟，果皮颜色黄带微白，基部很软； 1） 试验材料的处理方法 1-MCP处理 供试材料为‘雨花3号’桃果实。选取成熟度Ⅲ（5-6成熟）一部分材料以7~8个为单位，装在聚乙烯薄膜塑料袋中，20℃（95%以上的相对湿度）贮藏。实验处理包括：⑴ 对照，在20℃密闭处理24 h；⑵20℃下用1-MCP 500nl/L密闭处理24 h。处理后的果实于20℃下贮藏0、2、4、6、8、10天后按照上述同样操作取果肉部分，用液氮处理后保存于-80℃超低温冰箱中供分析使用。 C2H4处理 分别采用不同浓度外源乙烯（20μl/L、100μl/L和200μl/L）处理30 h后置于20℃、相对湿度大于95%条件下贮藏。每隔2天随机取样按上述操作将果肉部分用液氮冷冻处理后置于-80℃超低温冰箱，供分析使用。 2） 常规实验项目的分析方法 桃果实采后不同时期硬度的变化－ 使用GY-1型果实硬度计 桃果实采后不同时期乙烯释放量的变化－采用气相色谱法 细胞壁多糖类的分子量分布变化－采用凝胶过滤法 细胞壁多糖的单糖类的解离特性－采用气相色谱法 α-AF等基因的表达情况分析－荧光定量PCR 蛋白质表达－采用Western印迹法 果肉组织 CDTA-1 CDTA-2 Na2CO3-1 Na2CO3-2 KOH-1 KOH-2 KOH-3 0.05 mol · L-1 Na2C03溶液（含0.02 mol · L-1 NaBH4）1℃通N2提取20h 0.05 mol · L-1 CDTA溶液在20℃提取5小时 0.05 mol · L-1 CDTA溶液在20℃提取2小时 0.05 mol · L-1 Na2C03