(Western实验步骤.docVIP

一、样品制备 对于Western Blotting实验而言，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时，需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物），或者通过免疫沉淀等方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。 1. 样品收集 1）培养的细胞 贴壁和悬浮细胞收集方式不同，细胞裂解液种类各异，推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解，煮沸即可。 2）动物组织 与细胞不同，组织块由于体积较大，须预先经破碎匀浆处理。 2. 样品定量 样品电泳前需测定蛋白浓度，以便保证上样量一致，有利于后续定量或半定量分析。常用的蛋白质浓度测定方法有好多种，其灵敏度和所需时间不同，且不同的方法会受不同干扰物质的影响，实验者可根据样品制备方法（裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等）自行选择。 几种蛋白质浓度测定方法比较 ? 优点 缺点 Bradford法 迅速、灵敏 对各种纯化蛋白质反应不同 BCA法 简单、干扰少 耗时 Lowry法 不同蛋白差别小 干扰多，较慢 注意事项： a. 应尽量避免引入影响后续定量的杂蛋白（如细胞培养液、蛋白酶抑制剂等）及其他干扰物质； b. 样品浓度应适中，1×SDS凝胶加样缓冲液建议用量：贴壁细胞按10cm2培养皿/0.1ml,悬浮细胞按5×106细胞/0.1ml比例加入； c. SDS对蛋白质变性和电泳分离至关重要，浓度应控制在2-10%之间，并根据具体需要调整； d. 制备好的样品可以在-20℃保存，但时间不宜过长，并避免反复冻融，否则蛋白会发生降解； e. 内参对实验结果至关重要，应选择合适的内参。 二、电泳 电泳分为非变性凝胶电泳和变性凝胶电泳，Western Blotting中常用的是不连续缓冲系统下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），该法中由于变性的多肽与SDS结合而带负电荷，在凝胶电泳中迁移率仅与多肽的分子量相关。凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围? 丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（KD） 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212 注意事项： a. 根据目标蛋白的分子量选择合适浓度的凝胶，以达到最优的分离效果和分辨率； b. 分离胶不宜灌注过满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果； c. 各泳道上样体积最好大体一致且适中，体积偏差过大会相互挤压导致条带走形，为避免边缘效应，可在未加样的泳道加入等量的样品缓冲液； d. 电泳时应保持电压和电流稳定，且不宜过高，否则会造成不规则的蛋白质迁移带； e. 如有特殊需要，可以使用梯度胶，高浓度丙烯酰胺可以使低分子量蛋白质形成清晰的条带，还能在一块胶内同时分离分子量范围更大的蛋白质。 三、转膜 蛋白质经SDS分离后，必须及时从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性，而且支持物本身还有免疫反应惰性，这使其比直接在凝胶上检测更易操作，试剂用量更少，更省时，效果更好。 蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，分为半干式和湿式转印两种模式，与SDS结合的蛋白由于带有负电，在电场中向正极迁移，并最终结合在固相支持物上。两种方法均卓有成效，且各有所长，实验者可根据实验情况不同进行选择。 常用固相支持物? ? 硝酸纤维素（NC）膜 尼龙膜 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 灵敏度和分辨率 高 高 高 背景 低 较高 低 能力 80-110 ug/cm2 400 ug/cm2 125-200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合） 材料质地 干的NC膜易脆 软而结实 机械强度高 溶剂耐受性 无 无 有 操作程序 缓冲液润湿，避免气泡 缓冲液润湿 使用前100%甲醇润湿 检测方式 常规染色，可用于放射性和非放射性检测 不能用阴离子染料 常规染色，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测 适用范围 0.45um： 一般蛋白0.2um： 20kD蛋白0.1um：7kD蛋白 低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖（主要用在核酸检测中） 糖蛋白检测和蛋白质测序 价格 较便宜 便宜 较贵 注意事项 a. 样品属性、膜类型、胶浓度以及转移缓冲液均会影响蛋白质的转移效率，比如小分子量蛋白与大分子量蛋白相比，迁移迅速，但结合不牢固； b. 蛋白与固相支持物结合的程度受多种因素影响，如膜属性（孔径和类型），缓冲液属性（pH值、盐离子种类、盐浓度、去垢剂等），如实验结果不佳，可分别进行优化； c. 如果转膜与电泳的缓冲液系统不同，转膜前应将凝胶在转膜缓冲液中