分子生物学实验指导书..docVIP

分子生物学实验指导书 何华纲 编 江苏大学 食品与生物工程学院 2007年9月 目录 实验一 溶液的配制和器械的准备实验二 质粒DNA的提取与检测实验三 PCR技术扩增目的基因实验四 PCR产物与质粒DNA的酶切分析实验五 目的基因与质粒载体的连接和转化实验 重组质粒的鉴定（综合性实验）实验一 溶液的配制和器械的准备 一、实验目的 ①认识各种常用器械； ②掌握分子生物实验中常用溶液的配制方法； ③掌握高压蒸汽灭菌的方法，了解各种灭菌方法，树立无菌观念； ④掌握微量移液器的使用方法。 二、实验原理 1、溶液的配制与灭菌 （1）溶液浓度的表示 溶液的浓度，常用质量浓度摩尔浓度表示。 质量浓度，?g/?L等单位表示。如抗生素母液常以mg/mL作为浓度单位，DNA或RNA常以?g/?L作为浓度单位。质量百分浓度则是指用百分数（%）表示每100毫升溶液中所含溶质的质量数（g/100mL），如20% SDS，它表示每100mL溶液中含有20g的SDS（十二烷基硫酸钠）。 摩尔浓度，是指每升溶液中所含溶质的摩尔数，即mol/L。如mol/L EDTA，它表示每升溶液中含有摩尔EDTA（乙二胺四乙酸）。另外，mol/L EDTA常常可以写作M EDTA，这里的“M”就相当于“mol/L”。而摩尔数与质量的关系为： 摩尔数=质量（g）/分子量 无论是质量浓度，还是摩尔浓度，在定义时都是以一定体积为基数的，因此在溶液的配制过程中，不能将称量的溶质直接加入足体积的溶剂中，因为溶质溶解后也会占一定体积。比如，在配制100mL 的20% SDS溶液时，起先只加80mL纯净水，待SDS完全溶解后，再用水定容至100mL。 配制一种溶液，采用摩尔浓度还是质量浓度，主要依据使用时的便利。另外，两者之间也不是完全孤立的，可以进行有效的换算： 摩尔浓度=[质量浓度·体积数（mL）]/[分子量·体积数L）] =1000?质量浓度/分子量 体积百分浓度用溶质体积占全部溶液体积的百分数表示的浓度。（2）实验用水 总的来说，使用什么作为溶剂，以及随后如何调节pH值、如何灭菌处理等，必须在溶液的配制时查阅相关实验手册，最权威最全面最常用的是美国冷泉港所编著的《分子克隆实验指南》，目前已有第三版的中译本。 溶液配制中常用的溶剂是水，过去常用蒸馏水，现在多用结合反渗透膜、离子交换、活性炭吸附等技术的纯水装置制备的纯净水。按照过去的表述，蒸馏水有两种，一种是一蒸水（也就是一般所说的蒸馏水），它的纯度与离子交换蒸馏水差不多，多用于器皿的冲洗、电泳缓冲液的配制和细菌培养基的制备等；另一种是双蒸水，由一蒸水再次蒸馏得到，与纯净水的纯度差不多，可用于组织培养实验。必须注意的是，对于某些有机成分，只能用相关的有机溶剂或酸、碱溶液来配制。 （3）pH值的调节与定容 在分子生物学与基因工程的实验中，所用试剂（如电泳缓冲液、培养基等）往往应当具有一定的pH值，可以使用pH试纸测定，但需要更高精确度时可以使用pH计测定。在调节pH值时，采用添加酸或碱的方法，但必须考虑溶液的成分，添加相应的酸或碱，尽量保证不引入杂离子，比如调节Tris-HCl缓冲液的pH值时必须添加HCl，调节EDTA溶液的pH值时必须添加NaOH（因为EDTA本身就是钠盐）。 调节pH值后，就可以对溶液进行定容。这里不是分析化学实验，没有必要用容量瓶来定容，只要用量筒就可以满足精度要求了。值得注意的是，定容是在最后完成，因此在前面的配制过程中，不能将溶剂直接添加到目的体积。 溶液定容之后，装于适当容量的试剂瓶中，贴上耐高温的标签纸，图标签的一般写法在一张标签上需要工整地书写以下内容：溶液名称、浓度、pH值（必要时）和配制日期。（4）溶液的灭菌与保存 分子生物学与基因工程实验，一般都需要在无菌条件下进行，以避免杂菌的污染，或者对DNA或RNA的降解作用，因此必须对配制的溶液进行灭菌处理。溶液的灭菌主要有两种：高压蒸汽灭菌和滤膜过滤。一般的溶液都可以采用高压蒸汽灭菌，条件为121℃（蒸汽压为0.1-0.15MPa）保温15分钟。但遇到以下情况时，必须采用滤膜过滤：①含有遇热易分解的成分；②含有易挥发的成分；③含有有机溶剂；④含有腐蚀性、刺激性强的成分。如植物组织培养过程中的某些植物激素和细菌培养过程中各种抗生素，遇热很容易分解，配制后必须采用过滤灭菌，而且必须在经灭菌的培养基冷却到50℃以下，才能按比例添加到培养基中。 经过必要的灭菌处理后，常常将溶液放置在4℃冰箱，这样就可以较长时间地保存溶液，而不受杂菌的污染。 工作液与储存液 实验中使用的溶液可以分为工作液和储存液。工作液浓度较低，可以直接使用，但不利于溶液的长期保存，而储存液的浓度往往比较高，可以长