分子生物实验复习题2..docVIP

实验三 PCR产物的电泳、回收 目的基因的连接、转化 实验内容 1. PCR产物的电泳、回收； 2. PCR产物与T载体的连接 3. 感受态细胞的制备 ； 4. 连接产物的转化； 5. 铺制LB培养平版； 6. 涂菌培养过夜 。 一、 PCR产物的电泳及回收 1）PCR产物电泳： 15ul产物+3ul上样液 1%琼脂糖凝胶，100伏，30分钟。 2） PCR产物的回收（挤胶法） （1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放入封口膜中； （2）将切下来的胶块，标记好姓名，-20℃冰箱中 。 （3）放在封口膜内直接挤压，用加样器吸取挤压后得到的液体。 常见回收方法介绍 1、 冻融法： 1）? 在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下,-70oC冷冻至少15min。 2）?在65oC水浴中使胶融化，加入等倍体积TE-饱合酚,剧烈振荡30秒钟，然后-70oC冷冻15min。 3）? 室温融化后，12,000′rpm离心5min，将上层水相移 至另一管中，用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积3mol/L NaAc(pH5.2)沉淀、漂洗和干燥DNA。 2 、挤胶法 （1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放入小离心管中； （2）将切下来的胶块，-70oC冷冻15min； （3）放在封口膜内直接挤压，用加样器吸取挤压后得到的液体。 3、回收试剂盒（商业化）。 回收后鉴定 1）? 当回收的片段是用于与载体的连接，准确判断回收片段的DNA含量是非常重要的。将回收得到的片段进行电泳分析，通过与DNA Marker条带的比较，可以粗略判断回收片段的量，为连接反应估计加入多少目的基因片段提供参考，可增加连接效率。 2） 如何在胶上估计DNA的含量： DNA marker 参比法。（50ng/5ul） 电泳样本：Marker 5ul、T载体 1ul、回收片段。 电泳后通过判断电泳样品的亮度，大致判断连接片段和载体的比例。 二、PCR产物与T载体的连接 T载体一般是从公司购买的，因此，载体DNA的含量和浓度是已知的。连接反应成败的关键是估计目的DNA的量。可按下列配方进行连接反应： 回收的DNA片段 7 ml T载体 1 ml T4 DNA 连接酶buffer 1 ml T4 DNA ligase 1 ml 终体积 10 ml 轻弹管底混合，离心机甩一下，置25oC水浴1~2h。 连接产物可以直接用于转化，也可以置-20oC保存备用。 （低温连接效果比室温好） TA克隆原理 1、TagDNA 聚合酶的一个功能： 使PCR产物的3`端突出一个A。 2、商业设计的T载体：在3`端多出一个T。 3、两者的粘性末端可以互补配对。 PCR产物3`末断带有单个A，T载体是线性化DNA，其末端具有不配对的T， PCR产物与T载体是粘性末端连接，互补碱基先退火结合，然后连接酶在缺口形成磷酸二酯键。 应用时避免反复冻融，防止T的断裂丢失。如果与T载体连接后主要以自身环化为主，要考虑T可能已经丢失。 其他说明： 1）连接反应的关键是目的基因片段与载体的比例，一般片段与载体比例为2:1 或3:1（摩尔比），根据片段大小决定比例。 2）平端连接 平端连接通常需要先将载体的5￠端磷酸去掉，然后再进行连接，这样可以防止载体的自身环化。 当载体的5￠端磷酸去掉后，片段与载体的连接就会留下一个缺口，连接酶由于载体5￠端缺乏磷酸而无法形成磷酸二酯键，转化入细胞后，细胞内的酶会将缺乏的磷酸基团加上，再形成磷酸二酯键。 三、感受态细胞的制备 感受态细胞制备原理 培养至对数生长期的大肠杆菌在低渗 CaCl2 存在的情况下，细菌变得膨胀而易于外源基因的导入。 另外，钙离子溶液处理的细胞对外源DNA的摄取能力增强。 说明： 1）感受态细胞的膜已经很脆，应该超低温保存。 如果反复冻融会使细胞活力受影响，而且细胞膜的变化可能复原，由感受态细胞状态回转到普通细胞状态，失去接受外源DNA的能力。 2）无菌操作。 在火焰附近操作，火焰附近是无菌区。 各种器具均需消毒。 感受态细胞的制备 1）将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，置37oC12-16小时。 2）次日从琼脂平板上取一单菌落，于2ml LB培养基中，37oC，225rpm速度震荡培养12-16小时。 3）取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37oC， 225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(约3小时)。 4）?取1ml 菌液冰浴5min，然后6000rpm，离心5 min ，收集菌体