【2017年整理】HA-HI与免疫荧光.docxVIP

L1.配制准备溶液（2015/6/1） 实验仪器 托盘天平，药匙，100ml烧杯，电磁炉，pH试纸，牛皮纸，橡皮圈，高压灭菌锅，冰箱，移液器，移液枪，低速离心机，1000ml烧杯3个，50ml量筒1个，1000ml量筒一个 实验材料 葡萄糖5g 柠檬酸钠2g 柠檬酸1g 氯化钠1g 蒸馏水3L 稀盐酸100ml SPF鸡血 10ml Na2HPO4·12H2O 5g KCl 1g NaH2PO4·2H2O 2g NaOH 1000ml 实验步骤 鸡红细胞保存液（阿氏Alsevers液）配制 葡萄糖 2.05g 柠檬酸钠 0.8g 柠檬酸 0.055g 氯化钠 0.42g 加蒸馏水至100毫升，加热溶解后将pH值调到6.1，经过69千帕，15分钟的高压灭菌，放置在4℃的环境内，保存备用。 阿氏液主要用于保存红细胞，在4℃的环境下，红细胞可以保存2周而不改变活性和特性。因此阿氏液用于采血、保存和运送红细胞进行化验。 1%鸡红细胞悬液制备 采血 用注射器吸取阿氏液1ml，取至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液3-4ml，与等量的阿氏液混匀，装入离心管中备用。洗涤红细胞 将离心管中的血液经过1500-1800r\min离心8分钟，弃去上清液，在沉淀物中加入本实验要求的PBS液，轻轻混匀，以均匀沉淀的红细胞，在经过1500-1800r\min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀的红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后， 4℃保存备用。 1%鸡红细胞悬液制备 用微量移液器取洗涤后的红细胞沉淀泥0.1ml，加入到9.9ml本实验要求的PBS液，轻轻混匀，制成1%鸡红细胞悬液，备用。 pH7.2、0.01mol/L PBS的配制 配制25×PB：称量2.74g磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O）和0.79g磷酸二氢钠（NaH2PO4 2H2O）加蒸馏水至100mL。 配制1×PBS：量取40ml25×PB，加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至1000mL 用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2。 灭菌或过滤。 PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。 PBS对其它酸碱物质具有一定的缓冲能力，维持反应所需的pH，因而比使用生理盐水的效果好。 L2.实验仪器消毒 实验材料 ddH2O 实验仪器 150*15试管24个（3*7后续使用，3垫脱脂棉装针头），300ml三角瓶3个，镊子3个，眼科剪3个，纱布，报纸，牛皮纸，30ml注射器3个，蓝枪头3盒，黄枪头3盒，白枪头1盒，EP管半盒，盖玻片半盒，烧杯1个（盛EP管），小烧杯一个（盛盖玻片） 实验步骤 ddH2O清洗玻璃仪器 包装实验仪器 高温蒸汽灭菌（121°C，30min） L3.鸡胚发育 鸡胚的发育：要采用鸡胚进行细胞培养时，应对鸡胚的发育有一个初步了解。鸡胚的发育是由受精卵开始的，它在通过输卵管时，已开始分裂，当产卵时已在卵黄上部形成一层细胞，名为胚盘，在适宜的条件下胚盘继续分裂生长。在发育过程中由卵黄和卵白中获取养料和水分，由于胚体与卵黄分开的缘故，胚胎只通过卵黄带与卵黄相连。发育的早期形成三个胚层，即外胚层、中胚层和内胚层，由此形成胚胎的各个器官和组织。一般孵育至第3d出现尿囊，为直肠腹侧部分的膨出物，尿囊膜是由内胚层和中胚层构成的。至第4~5d胚体为羊膜、尿囊膜及绒毛膜层包被。羊膜系由外胚层和中胚层组成，开始时紧贴于胚体上，后来腔内逐渐充满羊水。尿膜在生长发育的过程中，与绒毛膜相连而成绒毛尿囊膜，此膜为三层细胞组成。外层为外胚层，内层为内胚层，中间为中胚层细胞，其中血管甚多有两条主动脉自卵黄囊延伸到此膜中，与此并行有两条主静脉，汇流成一较大的尿囊静脉。绒毛尿囊膜系鸡胚的呼吸器官，位于壳膜之内。此膜生长发育很快，第10d己包围了整个鸡胚，此时鸡胚己出现羽毛，呼吸道的发育在第12~15d之间出现。胚胎体积逐渐增大时，胚胎腔外体液亦日趋减少，孵出小鸡时已无胚胎腔外体液。在发育早期，尿囊液及羊水的成分与生理盐水溶液相差无几，12d后羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔积累了肾脏的排泄物，因此，在12d或13d后，尿囊液由于尿酸盐的存在，使原来透明的液体呈现混浊。尿囊液的酸碱度在7~12d期间呈弱碱性，在孵育的末期为pH6.0。6-13d鸡胚羊水的平均量为5~10mL，至13d有时可达10mL。卵白的水分在发育的最初7d中转移到卵黄囊内，在第16d卵臼转入羊水腔为胚胎所吞食。卵黄在发育时逐渐为一层细胞所包围，自12d以后卵黄逐渐干燥，在孵出之后24-48h，整个卵黄囊被吸入小鸡腹腔内，供雏鸡出生后最初几天的营养。 L4.鸡胚尿囊腔接种 实验材料 气管和殖泄道棉拭子，PBS液，链霉素/青霉素，石蜡油，70%酒精，3%碘酊 实验仪器 试