【2017年整理】8.ppt.Convertor.docVIP

八. 细胞培养的应用和研究进展 1 （一）细胞培养的应用 1. 体外诱导细胞分化 对细胞分化来说，最重要的是多个基因表达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合，并受不同层次的基因调控网络系统控制。这是一个彼此制约而又协调的复杂过程，即发育的遗传程序，遗传程序被记录在细胞基因组的结构中。 （1）正常细胞分化 2 （2）EC、ES和EG细胞系 胚胎性癌细胞（embryonal carcinoma cell，EC）： 是畸胎瘤干细胞，具有恶性生长并显示类似胚胎细胞发育全能或多能的双重性质。 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）： 来自小鼠早期胚胎的内细胞团或桑椹胚，基本上解决了研究哺乳动物发育和遗传以及细胞分化的模型问题，可以体外诱导分化和产生生殖系嵌合体后代。 胚胎生殖细胞（embryonic germ cell，EG）： 来自9－10天龄小鼠胚胎生殖嵴，与ES不完全一样，被称为“干细胞之母”，除了用以研究细胞分化，还为研究生殖细胞发育、分化和成熟的调节机制以及生殖系肿瘤发生提供了丰富的材料。 3 （3）ES细胞体外诱导分化 ①意义： ES细胞是研究某些体细胞（神经细胞、肌肉细胞等）的前体细胞起源和细胞谱系演变较为理想的实验体系。 体外培养系统能定性和定量地分析某些细胞因子、细胞外基质和诱导剂等因素对ES细胞生长和分化地影响，避免了体内各种内源性因素地干扰。 可进行基因工程，便于研究基因在胚胎发育中的功能和制备基因嵌合体动物。 定向诱导ES分化为单一类型的具功能性的体细胞，有潜在的临床医学应用前景。 4 ②基本原理： 应同时考虑诱导物性质（专一性）和ES细胞本身所具有的反应能力这两个基本问题，在时空上相互配合。 按作用机制诱导物可分为两类：一类是使被诱导细胞可逆性地轻度损伤，如无机盐、有机酸等都能使ES细胞渗透压改变而轻度损伤，导致神经细胞分化； 另一类是通过与被诱导细胞表面受体结合而介导的细胞诱导分化，如类固醇、维甲酸、多肽生长因子等。 5 ③基本方法： 单层ES细胞培养和诱导分化： ES细胞经0.25％胰酶消化成单个细胞 以2 Χ104 －5 Χ104 个/ml的细胞浓度接种于0.1％白明胶包被的培养皿。 添加适当浓度的细胞分化诱导剂，如维甲酸（RA），一般浓度为1Χ10－5 － 1Χ10－8mol/L 每隔两天更换含相同浓度诱导剂的新鲜培养液。1－2周可出现分化细胞。 较难分化为单一类型的细胞，常以某种细胞为优势，所以称之为混合型诱导分化细胞。 6 拟肧体培养和诱导分化： ES细胞经0.25％胰酶消化成单个细胞 通过软琼脂培养或悬滴培养3天后形成拟肧体。 收集ES细胞拟肧体，放入铺有0.1％白明胶的培养皿或微孔培养板，添加适当浓度的细胞分化诱导剂。 分化为单一类型的细胞。 7 ④ES细胞体外分化的细胞类型： 造血细胞，报道最多，分化的重复性高，频率高，无需添加昂贵的生长因子，可诱导分化为红细胞、髓细胞和淋巴细胞，以及造血干细胞。 内皮细胞与血管发生 神经细胞 心肌和其他肌肉细胞 脂肪细胞 软骨细胞 8 2. 细胞融合技术 细胞融合（cell fusion）是指两个或两个以上的细胞合并成为双核或多核细胞的过程。 受精过程、杂交瘤形成过程都属于细胞融合。 细胞融合的方法主要有病毒法、聚乙二醇法和电融合法。 （1）病毒法 疱疹病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒、仙台病毒等。最常用的是经紫外线灭活的仙台病毒（日本血凝病毒） 在病毒的作用下，细胞膜会发生一定的变化，先是细胞质融合，然后通过有丝分裂，细胞核合而为一，形成新的杂种细胞。 9 （2）聚乙二醇（PEG）法 最初用于植物原生质体的凝聚剂。后广泛用于多种动物细胞的融合实验。由于其易得、操作简单、效果稳定而成为标准融合液。 PEG分子量在200－6000之间均可用作细胞融合剂，其机制不甚明了。可能为改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组。由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。 10 （3）电融合法 20世纪80年代发展起来的一项细胞工程技术。融合过程容易控制、融合频率高、无毒性、作用机制相对比较清楚。 细胞电融合技术就是使细胞在电场中极化成偶极子，并沿电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 11 3. 体外受精技术 体外受精－胚胎移植（IVF－ET）又称试管婴儿，就是用人工的方法取出精子和卵子，在体外环境中受精和发育，待胚胎发育到一定阶段后将其移植到母体子宫进一步发育程胎儿直至分娩的过程。 三个主要发展阶段： 经典的IVF技术：诱发超排卵、取卵、体外受精、4－8细胞阶段移