重組人亲环素A的表达纯化-1104班吴敌.docVIP

Cyclophilin A的表达及纯化 报告题目 Cyclophilin A的表达及纯化 作者姓名 吴敌 班级学号 1104班2011114020409 指导教师 张新潮 完成时间 2014年11月 生物学实验教学中心  重组人亲环素A(rhCyPA)的表达纯化 吴敌（指导老师：张新潮） （湖北师范学院生命科学学院生物技术1104班 湖北 黄石 435002） 摘 要：将亲环素A基因片段插人原核表达载体pET 中, 得到重组质粒p ET-CyPA , 转入大肠杆菌获得高效表达。重组有CyPA基因的大肠杆菌M15在含有氨苄青霉素（100ug/ml）和卡那霉素（25ug/ml）的LB培养基中培养，当A600达到大约0.5时，终浓度为1mM的异丙基硫代–B-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养6h。提液经DEAE-Sepharose CL-6B柱层析得到纯化的重组CyPA。 β-转角及无规线团，8条反平行的β-折叠片段分别与环(Loop)和包埋于件折叠片段两端的3条α-螺旋相连接，形成一个右手R-桶型结构，内部形成疏水中心。 亲环素A (Cyclophilin A CyPA)具有肤基脯氨酸顺/ 反异构酶(PPIase) 活性和结合免疫抑制剂环抱素A 的能力[3,4]。后来发现CyP是一个在进化上相当保守、功能相关的蛋白质家族, cyPA 是这个家族中最主要的成员。近年发现全身性红斑狼疮等自身免疫病人体内存在抗CyPA自身抗体, 检测CyP 抗体有助于了解自身免疫病的发病机制和进行临床诊断[5] . 这些工作都需要大量纯化的人CyPA。用大肠杆菌体外表达人CyPA, 能满足这些工作需要, 避免了从人组织提取纯化的麻烦。此外, 利用基因克隆表达技术还能进行定点突变, 作为其结构、动力学和作用机制研究的辅助手段。 本研究在对CyPA 基因进行了克隆和序列测定的基础上, 构建了表达载体, 在大肠杆菌中获得高水平表达[6]。 1.实验材料与试剂 1.1实验材料 c115a菌种（大肠杆菌） 1.2抗生素储备液 ?C保存备用。使用时每毫升培养基加入0.7～1?L，终浓度为70～100?g/mL。 卡纳霉素储备液：用无菌二次重蒸水配成10mg/mL卡那霉素（kanamycin，简称Kan）溶液，分装，-20?C保存备用。使用时每毫升培养基加入3～5?L，终浓度为30～50?g/mL。 1.3IPTG储备液 将2g异丙基硫代--D-半乳糖苷（isoprophyl thio--D-galactoside，简称IPTG），溶于二次重蒸水中，过滤除菌，分装，-20C保存备用 1.4缓冲液 不同浓度的Tris-Hcl缓冲溶液 1.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 试剂 用量 12%Gel 5ml 双蒸水 1.6ml 30%丙烯酰胺 2.0ml 1.5M Tris-Hcl（pH=8.8） 1.3ml 10%SDS 0.05 10%过硫酸铵 0.05 TEMED 0.002 浓缩胶（5%Acrylamide） 1 双蒸水 1.4 30%Acrylamide 0.33 1.0M Tris-Hcl 0.25 10%过硫酸铵 0.02 10%SDS 0.02 TEMED 0.0 →装柱→平衡→样品制备→上样(1x体积的缓冲液)→洗脱（先校准，在加样，速率为4min一管）→收集液体（观察显示器上的图线趋势并记录出现波时的管）→还原 2.5电泳 1）制作凝胶，并用水相液封，胶体凝固后制备浓缩胶并插上梳子 2)将loading buffer5ul与20ul的蛋白混和进行电泳，先是电压为60v，在 蛋白跑到浓缩胶处换电压140v直到跑完整个胶板 3）在考马斯亮蓝液体中加热至煮沸停止加热，使染色。 4）在清水中煮胶，至能够看到条带停止加热。重复两次 5）在冷水中漂开，在扫描仪下扫描，可以观察到蛋白的印迹。 6）保存结果 3 结果与分析 3.1蛋白电泳图 第一次电泳选择的是2,4,6,8,10,12,14,16,20,22,24，其中12管没有蛋白，14号出现有蛋白，22号管以后没有蛋白出现，最纯为16号管。 结果说明了：13管可能存在有蛋白，14管以后到22号这一段都含有蛋白，可以进行检测，用于说明目的蛋白的存在。 第二次电泳结果选用的是buffer，初提液，13管，混合液（14,15,16,17,18,19,20,21,22），第二次提取液 结果表明：初提液中含有较多的杂蛋白，13管有蛋白出现，混合液中蛋白较为专一。 3.2蛋白层析图谱