【2017年整理】PEG沉淀法-病毒提纯方法.docxVIP

1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation.2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to 7.2-7.5. Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v).3. Stir at 4℃for 2 hours.4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours.5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( e.g., RNase-free ddH2 for virus RNA prep).沉淀法-病毒提纯方法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀 法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。　1.中性盐沉淀法：病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。　　2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主 要是分子量为2 000～6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年) 成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。3.有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。　4.等电点沉淀法：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。多数病毒的等电点在pH4.5～5.5之间，因此在pH3～6范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。　5.皂土法：Girin(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH4～4.5)吸附轮状病毒SA-11，再在碱性条 件下（pH8.5），又使其洗脱下来，从而达到纯化目的。??6.鱼精蛋白沉淀法：鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/LNaCl时，病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)( Polyethylene Glycol 简写为 PEG)，它的亲水性强，溶于水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的 PEG。PEG 的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液pH 和温度等因素的影响。在一定的pH 值下，盐浓度越高，所需PEG 的浓度越低，溶液的pH 越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG 的浓度越低。在一定范围内，高分子量和高浓度的PEG 沉淀的效率高。以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，其解释主要有：①认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。有机聚合物沉淀的优点是：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性；②沉淀效能高，使用很少量的PEG 即可以沉淀相当多的生物大分子；③沉淀后有机聚合物容易去除。水溶性非离子型聚合物沉淀法常用的聚合物为聚乙二醇（PEG）及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白质的机制尚不清楚，大致有如下解释：①聚合物与蛋白质形成共沉物；①聚合物与蛋白质之间发生水的重分配；①聚合物与蛋白质形成复合物。此法受许多因素影响，主要是pH、离子强度、蛋白质浓度和PEG的分子量等。分子量为 2000～6000的PEG皆适宜于做蛋白沉淀用。如若使用得当，效果甚为满意。一般认为，PEG浓度在3％～4％时沉淀免疫复合物，6％～7％可