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章鱼工业废水的多糖提取方法浙江工业大学药学院 于海宁陈诗桦 宓能炬 李小文 李然 黄家豪摘要：通过章鱼废水的浓缩，去蛋白，醇沉，得到我们所要的多糖。浓缩基本采用旋蒸，浓缩后去蛋白，预计采用Sevage法脱蛋白或等电点法除蛋白，去蛋白后采用特定比例的95%乙醇进行醇沉。本实验旨在探索多糖提取方法中产率最高的方法，对章鱼废水的多糖提取进行优化改进。关键词：章鱼废水，多糖，提取，改进正文：1前言海洋生物多糖包括来源于海洋藻类、海洋微生物和海洋动物的多糖，因其特殊的结构和生物活性受到了人们的广泛关注，并已成为现代糖化学与糖生物学及海洋药物研究领域的热点之一。海洋动物多糖特别是从海洋软体动物中提取的糖类化合物，在抗凝血、抗肿瘤、免疫调节和改善记忆等方面显示出的药用价值更是引起了国内外学者的研究兴趣。目前的研究发现，在300余种海洋无脊椎动物中都存在具有多种生物活性的糖蛋白，但因海洋动物多糖结构的多样性和复杂性，其研究与开发面临着巨大的挑战。2材料与仪器章鱼废水20L，旋蒸仪，PH计，高速离心机，紫外分光光度计3实验方法3.1用旋蒸仪浓缩以下为我使用旋蒸的注意事项：1.安装接口部分要加少量凡士林，避免抽真空的时候，接口部分漏气真空度上不去。?2.茄形瓶溶液装溶剂一般不能超过50％。?3.关闭仪器的时候必须先减压再关闭真空泵，防止倒吸。?4.使用过程必须有人在场，暴沸时进行减压操作。?5.根据溶剂设定加热温度，一般溶剂沸点80度，可以设定加热温度50－55度。?6.一般先开冷却装置，再加热防止溶剂挥发。7.回收溶剂瓶一定要用升降台支撑好，防止回收溶剂多时瓶子掉下来。3.2通过采用Sevage法脱蛋白或等电点法除蛋白3.2.1采用Sevage法脱蛋白除蛋白以酶提粗多糖溶液为原料，按体积比1:1加入Sevage液(氯仿/正T醇=4/l)，磁力搅拌30min后离心，上清液再加Sevage液磁力搅拌30min离心，上清液浓缩后采用截留相对分子质量为8一12kDa的透析膜透析Zd，将透析液离心去除杂质，浓缩后用3倍体积95%乙醇4OC冰箱放置过夜，离心、洗涤、烘干得Sevage法脱蛋白腕部水提、酶提多糖，测其蛋白含量和收率。3.2.2采用等电点法除蛋白以腕部水提、酶提粗多糖溶液为原料，用4mol.L一NaoH溶液调pH，离心，章鱼多糖的提取，然后用4mol.LHCI溶液调pH3，4℃冰箱放置过夜，离心后上清液采用截留相对分子质量为8一12kDa的透析膜透析Zd，将透析液离心去除杂质，浓缩后用3倍体积95%乙醇4℃冰箱放置过夜，离心、洗涤、烘干得等电点法脱蛋白后的腕部水提、酶提多糖，测其蛋白含量和收率。3.3 用95%乙醇进行醇沉取浓缩后的章鱼废水100ml5份，分别加入1:1, 1：2, 1:3，1:4, 1:5比例加入95%乙醇，取某一次的数据如下：章鱼废水：乙醇 干燥后的多糖1:1 0.1279g1:2 0.1901g1:3 0.2847g1:4 0.2977g1:5 0.2978g绘制图表如下：根据图表可得，采用1:3的比例醇沉既不会浪费乙醇，又能得到较高的多糖产率3.4干燥醇沉产物可得干燥的多糖 4结果4.1通过苯酚硫酸法测定去蛋白后的多糖含量，来判断两种去蛋白方法的优劣制作葡糖糖标准曲线 ①准确称取0.1g葡萄糖，加蒸馏水溶解移至100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，得浓度为1.0mg/mL的葡萄糖标准溶液 ②用1.0mg/mL的葡萄糖标准溶液配制浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL的葡萄糖标准溶液 ③取上述溶液各1mL于具塞试管中，分别加入6%苯酚1mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5mL，摇匀，室温静止10min，置于37℃水浴锅中静止18min，迅速用自来水冷却，于490nm波长下测吸光度（A），空白管以蒸馏水代替糖溶液，以糖浓度μg/mL为横坐标，吸光度（A）为纵坐标得标准曲线浓度（ug/ml） 10 20 30 40 60 80吸光度(A) 0.110 0.208 0.334 0.471 0.700 0.954计算得各自浓度： 3.5ug/ml(原废水中)，2.5ug/ml(等电去除)，2.4ug/ml（sevage