植物组织培养实验讲义描述.doc

植物组织培养是60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官、组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整再生植株的过程。 植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。例如，组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种、幼胚培养与试管受精，抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究和实际应用，都必须借助植物细胞组织培养技术的基本程序和方法。此外，植物细胞组织培养技术也有助于我们深刻理解植物细胞的全能性。 实验一母液及培养基的制备 一、实验目的 1了解植物外植体离体培养所需各种营养成分及激素种类。 2初步掌握培养基母液配制方法。 3学习掌握培养基配制方法与灭菌操作。 4制备实验用的培养基。 ?二、实验原理 现在配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉，其中含有无机盐、维生素和氨基酸。把这种干粉溶解在蒸馏水里（要比培养基的最终容积少10％），加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，最后再加入蒸馏水使之达到最终的容积。调节pH，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。 干粉培养基可用于常规的实验目的，如植物的快速繁殖等，在这类实验中所需的培养基就可以节省时间和金钱。然而，如果在一项实验中必须对培养基中的有机或无机成分做一些较大的定性和定量的改动，或者当买不到干粉培养基或嫌干粉培养基价钱太贵的时候，有两种可能的方法配制培养基。一个方法是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。但这样操作非常繁琐，而且容易出错。在配制培养基之前，为了使用方便、简化操作、用量准确，减少每次配药称量各种化学成分所花费的时间和误差，常常将配制培养基所需无机大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素成分分别配制成比需要量大若干倍的浓缩母液，置于冰箱内保存。当配制培养基时，按预先计算好的量分别吸取各种母液即可。表1.1中列举了一系列的浓缩贮备液：①大量元素（浓缩20倍）；②微量元素（浓缩200倍）；③铁盐（浓缩200倍）；④除蔗糖之外的有机物质（浓缩200倍）。在制备这4种贮备液的时候，应使每种成分分别溶解，一粒不剩，然后再把它们彼此混合。各种生长调节物质制定储备液应当分别配制，如果它们是不容于水的，则应先把它们溶解在很少量的适当溶剂中，然后再加蒸馏水到最终容积。取决于所要求的生长调节物质的水平，其贮备液的浓度可以是l mmol/L，也可以是10 mmol/L。所有的贮备液都应贮存于适当的塑料瓶或玻璃瓶中，置冰箱中保存。铁盐贮备液必须贮存于琥珀色玻璃瓶中。在贮备椰子汁（液体胚乳）的时候，要先把由果实中采集到的汁液加热煮沸以除去其中的蛋白质，过滤，然后置塑料瓶中贮存于-20℃的低温冰箱内。作为一项规则，在使用这些贮备液之前必须轻轻拨动瓶子，如果发现其中有沉淀悬浮物或微生物污染，必须立即将其淘汰。 在制备贮备液和培养基的时候，应当使用蒸馏水或无离子水，以及高纯度的化学试剂。 表1-1 MS培养基的贮备液 成分 用量（mg/L） 备注 贮备液Ⅰ（大量元素母液） 20× KNO3 38000 定容于1000mL蒸馏水中。每升培养基取此液50mL。 NH4NO3 33 000 MgSO4?7H2O 7400 KH2PO4 3400 CaCl2?2H2O 8800 贮备液Ⅱ（微量元素母液） 200× MnSO4?4H2O 4460 定容于1000mL蒸馏水中。每升培养基取此液5mL。 ZnSO4?7H2O 1720 CuSO4?5H2O 5 H3BO3 1240 Na2?MoO4?2H2O 50 KI 166 CoCl2?6H2O 5 贮备液Ⅲ（铁盐母液） 200× FeSO4?7H2O 5560 定容于1000mL蒸馏水中。每升培养基取此液5mL。 Na2?EDTA?2H2O 7460 贮备液Ⅳ（有机母液） 200× 甘氨酸 400 定容于1000mL蒸馏水中。每升培养基取此液5mL。 盐酸硫胺素 100 盐酸比多醇 100 烟酸 100 肌醇 20000 三、实验用品 1．用具器材?? 电子天平（感量0.001g）、粗天平（感量0.5g）、冰箱、烧杯（1000mL、400 mL、100 mL、 50 mL）、量筒（1000 mL、100 mL、50 mL）、试剂瓶（1000mL、250mL、150mL）、药勺、玻璃棒、移液管（5mL、1mL）、pH试纸（5.4-7.4）、橡皮吸球、橡皮筋、吸水纸、磁力搅拌器、高压灭菌锅等。 2．药品试剂 蒸馏水、1 m