沙門菌监测标本采集及检测的基本要点.docVIP

附件2： 沙门菌监测标本采集及检测的基本要点 一、标本采集 标本采集应在2小时内用无菌方法采集新鲜标本，置于灭菌容器中或直接接种于增菌培养基中，写上标本编号并填写采样登记表，将标本与采样登记表一同送到指定实验室，如路途较远，标本要存放在专用的标本运送箱内，包扎好以免容器破损。 1.粪便标本 宜在服用抗菌素前采集，尽快送检。 （1）留便 用棉拭子采取自然排出的新鲜粪便2～3克。 （2）肛拭 用棉拭子在生理盐水中蘸湿后（棉拭子贴管壁挤出多余的液体），轻轻旋转插入肛门内约4～5cm（婴幼儿约2～3cm）处，于紧靠肛环边的隐窝处旋转采集直肠表面黏液后退出，棉拭上要沾有粪便。 采集的粪便标本立即放置采样管送检，如2小时内不能送检时，将肛拭或用采样拭子沾满粪便插入运送培养基（Cary-Blair，C-B）内保存，常温条件下运送至实验室。 2.可疑食品标本 固体食品需剪碎和研磨，奶和奶制品可直接取样增菌。 二、标本增菌 1.粪便标本 将标本立即接种于加有磺胺抑菌剂－亚硒酸盐煌绿的增菌液（Selenite Brilliant Green Sulfa Enrichment，SBG），37℃培养18～24h。 哨点医院可先将标本插入3～5ml缓冲蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）中37℃预增菌4～6h，然后再将预增菌处理后的标本按检验项目要求取0.1ml接种至9ml各相应选择性增菌液37℃培养16～18h。 2.食品标本 可疑食品固体25g研磨后或液体25ml先于225ml BPW中37℃ 8～12小时进行前增菌。取前增菌液0.1ml加入9ml RVS中，置40℃继续增菌16～18小时（此项仅用于暴发食物中毒原因调查时）。具体操作及所用的培养基、鉴定方法参考《中华人民共和国国家标准（食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验）GB 4789.4-2010》。 三、分离培养 接种环提取1满环（约10ul）增菌液，划线分离到科玛嘉沙门菌显色培养基/HE、XLD（木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂）琼脂平板各1块，置37℃ 24h分离培养，如果没有观察到有可疑菌落生长，再继续培养24h，观察结果，挑取可疑菌落（见表1）。 表1 沙门菌及大肠菌在选择培养基上菌落生长特征 选择性 培养基 沙门菌 大肠埃希菌 菌落颜色、形态 菌落颜色、形态 MaC 无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形 粉红或红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则 XLD 粉红或无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形a 黄色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则 科玛嘉 紫色、光滑、湿润、边缘整齐、圆形 蓝色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则 DHL 无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形a 粉红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则 SS 无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形a 粉红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则 HE 蓝绿色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形a 黄色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则 血平板 无色、透明、无溶血环、光滑、湿润、边缘整齐、圆形 灰白色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则 注： a. 产H2S的菌落呈黑色 四、生化鉴定和血清分型 1.生化初筛：从上述各平板上分别挑取至少5个可疑菌落，转种到双糖铁琼脂斜面（KIA），37℃18～24小时培养，观察初步生化反应（见表2）。 第一天：KIA：穿刺2/3中段，在斜面上划线。36℃培养18～24h，观察生化试验结果。 第二天：符合沙门菌KIA反应的，取该管斜面菌苔转种：MIU：穿刺接种培养基，并沿穿刺线拔出接种针。赖氨酸脱羧酶：接种少量菌苔，倒一层灭菌的石蜡油在上层。ONPG：接种一满环菌（2h读取试验结果）。（营养琼脂斜面：在斜面上划线，用于氧化酶试验，并做药敏试验及菌种保存的准备。）36℃培养18h～24h， 第三天：观察赖氨酸脱羧酶反应试验结果。符合：K/A、产气＋、H2S±、动力＋、靛基质－、尿素－、ONPG－、赖氨酸＋、氧化酶－结果者，做血清分型试验。 表2. 用克氏双糖(KIA))、动力-吲哚-尿素(MIU)、赖氨酸脱羧酶及氧化酶生化反应 初步鉴别沙门菌与其它常见肠道菌 细 菌 KIA MIU 赖氨酸 ONPG 氧化酶 斜面 底层 H2S 气体 动力 吲哚 尿素 沙门菌属 K A D D + – – + - – 伤寒沙门菌 K A +w – + – – + - – 甲型副伤寒沙门菌 K A – + + – – – - – 乙、丙型副伤寒沙门菌 K A + + + – – + - – 亚利桑那菌属 D A + + + – – + + – 普通