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实验五大肠杆菌感受态的制备(CaCl2法)
实验五 大肠杆菌感受态的制备(CaCl2法) 实验目的 学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。 实验原理 用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 受体细胞经过一些特殊方法(如:电击法,CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。 实验仪器、材料与试剂 (一)仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 低温离心机 5. 微量取液器 (二)材料 大肠杆菌DH 5α。 (三)试剂 1. LB液体培养基 2. 0.1mol/L CaCl2溶液 实验步骤 1. 挑取大肠杆菌DH 5α的单菌落,接种于5ml LB液体培养基中,37℃振荡培养14hr。 2. 取2mL菌液加入100ml LB液体培养基中,扩大培养约2-3h;测OD600值,当OD600约0.4-0.5时,停止培养。 3. 菌液冰上放置10min,无菌条件下移入50ml Beckman离心管中,4℃,3,500rpm,离心5min。 4. 弃上清,在冰浴上加入8ml预冷的无菌CaCl2 (0.1 mol/L),轻摇使细胞悬浮。冰上放置5min。 5. 4℃,3,500rpm离心5min。 6. 弃上清,用1ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)重新悬浮细胞,200μL/份分装到预冷的无菌Ep 管中,4℃保存备用。 (如加入15%的甘油,-70℃保存,可保存一年)。 实验结果与讨论 感受态细胞长时间处在常温状态,会严重影响到其转化率,因此应尽量减少常温操作,动作要迅速。 为减少对细胞的机械损伤,操作时动作不能剧烈。 尽量在无菌状态下操作,减少污染的可能。 * * 1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果与讨论
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