对虾白斑综合症病毒与黄头病毒双重快速检测试纸条..docx

对虾白斑综合症病毒与黄头病毒双重快速检测试纸条摘要：双重检测白斑综合症病毒(WSSV)和黄头病毒(YHV)试纸条是建立于特定地对WSSV包膜蛋白VP28(W1和W30)和YHV核壳体蛋白p20(Y19和Y21)的使用单克隆抗体(MAbs)上。单克隆抗体W30和Y19与胶体金结合并喷到紧挨玻璃纤维垫的样品小室内。单克隆抗体W1和Y21羊抗鼠免疫球蛋白G(GAM)抗体被分别喷到硝化纤维膜条的位置指定W,Y和C。这些试纸条被干燥存储在一个塑料袋里并放置在塑料盒子中。取对虾的游泳足作为样本，来评估试纸条对WSSV和YHV的检测能力。将游泳足匀浆在100μl缓冲液中，并置于试纸条的样品小室中，顺着消化纤维膜条流动，并可以在15分钟内被观察到抗体蛋白复合物。样本中虾被WSSV和(或)YHV感染,病毒蛋白将会结合到胶体金单抗上。这些复合物会被在测试线W和（或）Y上的单抗俘获,造成外观可见的颜色带。任何未结合胶体金单抗的，就会通过W和Y线，被GAM抗体俘获,在C处形成条带。当样本不包含WSSV和YHV蛋白质或含量低于检测下限的病毒蛋白的测试，只能C处观测到条带。灵敏性测试与使用单一单抗斑点印迹试验相对比，500倍的敏感度低于对WSSV的1-stepPCR和1000倍的敏感度低于对YHV的RT-PCR。尽管如此低灵敏度,双重检测试纸条在速度、简单的操作和在不需要复杂的设备或专业技能依然具有优势。而且此试纸条能同时检测WSSV和YHV的能力也节约了花销。背景介绍白斑综合征病毒（WSSV）和对虾黄头病病毒（YHV）是对虾商品化养殖中最常见的具有高传染性的病毒。这些病毒已经造成非常严重的经济损失，尤其在泰国，过去十年里它们已经导致了10亿美元的损失(Flegel, 2006)。各种分子方法已经开发来用于这些病毒的诊断，包括对WSSV的PCR分析(Takahashi et al., 1996; Lo et al.,1996; Srisala et al., 2008)；对YHV的RT-PCR分析（Wongteerasupaya et al.,1997; Cowley et al., 2004）；对YHV的qRT-PCR分析（Dhar et al., 2001; Maet al., 2008）；对WSSV的环介导等温扩增（LAMP）（Jaroenram et al., 2009）和对YHV的RT-LAMP（Mekata et al., 2009)）。这些方法中，PCR和qPCR由于其高的灵敏度和特异性，已用于广泛用于检测和研究。免疫学为基础的同时使用多克隆抗体（PABS）和单克隆抗体（MAbs）的诊断方法，已经开发了用于WSSV检测（Nadala et al., 1997;Nadala and Loh, 2002; Poulos et al., 2001; Anil et al., 2002;Liu et al., 2002; Chaivisuthangkura et al., 2004, 2010）和YHV的检测（(Nadala et al., 1997; Sithigorngul et al., 2000, 2002）。然而，这些免疫学为基础的技术，只能在实验室由训练有素的人员执行。这些技术的进一步优化令到免疫层析法试纸条发展到可以进行对WSSV的检测（Powellet al., 2006; Sithigorngul et al., 2006）和对YHV的检测（Sithigorngul et al.,2007）。这些试纸条的特性是其简单性和便利性；结果可以迅速地获得，不需要复杂的工具或专业技能。此外，这种方法可用于筛选个别虾或养殖池中的虾样品来确认相对高水平的病毒感染（相比于基于PCR的方法）。且可以方便地用于由养殖户自己监控两种病毒的感染情况。在被用于检测WSSV与YHV的开发的单一检测试纸条中（Sithigorngul et al., 2006, 2007），被用作俘获抗体的多抗作为测试条的测试线的主要组成部分。除了数量上的控制上，多抗在质控上明显地要比单抗要不可靠。在这份报告中，新的针对WSSV的单抗（W1和W30）和针对YHV的单抗（Y21）会替代多抗更加有效地作为试纸条的检测线（Sithigorngul et al.,2006, 2007）；并且原本检测两种病毒的两条试纸条会被整合到一条双重检测的试纸条上，以更加方便地使用单一制剂检测两种病毒。材料和方法2.1．病毒的准备从泰国中部佛统府挽铃县的农场获得的称重过后10～15g的南美白对虾（凡纳滨）对虾自然感染YHV。从泰国南部宋卡和Prajuabkirikhan省的农场获得，10～15g并称重的南美白对虾自然感染WSSV。从被感染的虾截取了两游泳足，匀浆并加入100μl0.3M磷酸盐缓冲盐水