Gen-Probe结核分支杆菌检测仪介绍(Bruce)分析.ppt

Gen-Probe检测分枝杆菌试剂类型 扩增+杂交检测结核分枝杆菌复合菌: AMPLIFIED MTD ( Gen-Probe) 临床痰标本(涂阳或涂阴) 杂交检测分枝杆菌: ACCUPROBE Gen-Probe 培养阳性标本 (菌落或肉汤) MTD (AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct) 检测 结核分枝杆菌复合菌: M.tuberculosis 结核分枝杆菌 M.bovis 牛分枝杆菌 M.bovis BCG 牛分枝杆菌BCG M.africanum 非洲分枝杆菌 M.microti 田鼠分枝杆菌 M.canetti 卡氏分枝杆菌 Gen-Probe MTD检测 以16S rRNA 为靶核酸 TMA ：转录介导扩增 HPA：杂交保护分析 RNA与 DNA DNA 非常稳定，在死亡生物内也可存在 双链结构 RNA 只存在于活细胞 非常脆弱 (RNA容易受破坏) 单链结构 结核菌核酸 RNA是DNA的4-5倍 rRNA占80% Gen-Probe 扩增 3 个主要步骤 标本处理 释放 rRNA TMA rRNA 扩增物 HPA 检测扩增物 超声波裂解 TMA转录介导扩增 2条引物： 2种酶： *逆转录酶(双功能:逆转录和RNAse H酶) (RNAse H：一种核糖核酸内切酶，特异性水解DNA：RNA杂交链上RNA链的磷酸二酯键，产生5核苷酸，该酶对单链核酸、双链DNA或双链RNA没有作用) *RNA聚合酶 等温扩增：42℃ 敏 感 10 000 拷贝 rRNA 扩增产物检测：HPA技术 HPA：杂交保护分析技术 标记丫啶酯（Acridinium ester）的DNA 探针与 RNA 扩增产物杂交，形成DNA：RNA双螺旋结构保护荧光物丫啶酯不被选择试剂淬灭（水解）。 HPA 步骤 丫啶酯标记的特异 DNA探针与RNA扩增物杂交 使用生化水解方法，分离杂交及未杂交探针 检测：化学发光检测 试剂1：0.001N硝酸中含0.1%过氧化氢； 试剂2：1N NaOH 杂 交 杂交温度的影响 选 择 检 测 敏 感 度 比 较 化学发光 10-19 mole 辐射同位素 10-18 mole 荧光 10-12 mole 比色 10-9 mole 总 结 靶核酸: rRNA 等温扩增，2种酶是关键（逆转录酶(RNAse H)、RNA 聚合酶） 扩增原理：TMA（转录介导扩增） 液相杂交：HPA（杂交保护分析） 化学发光法：检测杂交信号 扩增 : TMA 加入试管 : 扩增试剂, 石腊油 经过预处理的标本 消化 95 ℃, 15 分钟 水浴 42 ℃, 5 分钟 加入 酶试剂 扩增 42 ℃, 30 分钟 SFP - T000 A - 12/10/99 - p * Gen-Probe分枝杆菌快速检测仪 样本 显微镜 (Ziehl..) 敏感性低 培养 敏感性高 2 到8 周 改良罗氏培养基 Coletsos 液态培养基 (MGIT, Bactec, BacT Alert...) 鉴定 生化检测 实验条件苛刻, 需数天 (Reference center) 目视检测 准确低 MTD 2.5小时 敏感性高 – 特异性强 Accuprobe 1 小时 简单- 准确 分枝杆菌 :用Gen-Probe 产品检测程序和时间 样品 细胞溶解 目标 rRNA 释放 引物1 靶rRNA RT RT DNA RNA RNAse H 作用 DNA RT 引物2 DNA 模板 RNA 合成酶 RNA 扩增物 100-1000 拷贝 RT 引物2 RNAse H 作用 RT 引物1 逆转录酶 TMA原理 C A T A T A T G C G C A T T A A T C G T A G C G C G C A T A T G C T A C G T A DNA RNA 聚合酶 (eg : E.coli) AE AE 60℃ 杂交 rRNA 探针 AE AE AE AE AE AE AE 60℃ 61℃ 59℃ AE AE AE 非特异结合 无杂交 假阴性高 假阳性高 60℃ 选择试剂 AE AE AE AE AE AE AE AE CH3 N+ O O R H2O2 / OH- light MTD 方法 STEP1：标本