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8 亲和色谱 8.1 生物亲和作用 8.1 生物亲和作用 8.1 生物亲和作用 生物体内相互作用的分子对： (1) 酶—底物或抑制剂或辅酶 (2) 抗原—抗体。 (3) 激素—受体。 (4) 糖蛋白与凝集素, (5) 生物素—生物素结合蛋白等 8.1 生物亲和作用 8.1.2 影响亲和作用的因素 离子强度 pH值 抑制氢键形成的物质 温度 离液离子 螯合剂 8.1 生物亲和作用 8.1.3 亲和作用体系 8.2 亲和色谱原理 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。配基必须偶联于不溶性母体上。母体又称为载体或担体，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝照、聚丙烯酞胺凝胶和纤维素等。 当用小分子化合为作为配基时，由于空间位阻作用，难于与配对的大分子亲和吻合，常在母体与配基之间引入适当长度的连接臂。 要使不溶性母体与配基偶联或通过连接臂与配基偶联，必须先使母体活化。即通过某种方法(如溴化氰法、叠氮法等)，使母体引入某一活泼的基团，才能以共价键与配基偶联。活化后的不溶性母体已有商品出售。商品名为偶联凝胶。 亲和色谱（Affinity chromatography） 8.2 亲和色谱原理 8.2 亲和色谱原理 8.2 亲和色谱原理 8.3 亲和色谱介质 8.3 亲和色谱介质 8.3 亲和色谱介质 手臂 作用 ：减少亲和作用空间位阻 连接：通过化学反应与活化基团连接 手臂化合物： 乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2 已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 6-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH 环氧氯丙烷 1，4- 丁二醇缩水甘油醚 8.4 亲和吸附平衡 8.4 亲和吸附平衡 8.4 亲和吸附平衡 8.5 亲和色谱过程分析 8.5 亲和色谱过程分析 8.6 亲和色谱的应用 8.6 亲和色谱的应用 8.6 亲和色谱的应用 8.6 亲和色谱的应用 8.6 亲和色谱的应用 8.6 亲和色谱的应用 8.6 亲和色谱的应用 8.6 亲和色谱的应用 8.7 亲和膜色谱 8.7 亲和膜色谱 8.7 亲和膜色谱 8.8 其他亲和分离技术 亲和层析包括进料吸附、清洗、洗脱和介质再生几个步骤。 吸附操作要保证吸附介质对目标产物有较高的吸附容量，杂质的非特异性吸附要控制在尽可能低的水平。一般杂质的非特异性吸附与其浓度、性质、载体材料、配基固定化的方法以及流动相的离子强度、pH和温度等因素有关。为了减小吸附操作中的非特异性吸附，所用的缓冲液的离子强度要适当，缓冲液的pH应使配基与目标产物及杂质的静电作用较小。 料液流速是影响层析速度和效果的重要因素。提高流速虽可加快分离速度，但会降低柱效。此外，琼脂糖容易受压变形，压力过大反而流速降低。 8.5 亲和色谱过程分析 清洗操作目的是洗去介质颗粒内部和颗粒间空隙中的杂质，一般使用与吸附时相同的缓冲液。 目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。当亲和作用很大，用通常的方法不能洗脱目标产物时，可用尿素或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物变性，失去与配基的结合能力。但应注意目标产物变性后能否复性。 洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充分平衡亲和柱，以备下次使用。 8.5 亲和色谱过程分析 1） 层析前：制备亲和层析剂 选择 根据欲分离物质特性 配基 选择 根据配基分子大小及基团特性 载体 2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。 包括：非专一性洗脱和专一性洗脱 偶联 亲和层析剂 操作： 非专一性洗脱： 改变温度 改变pH值 改变离子强度 专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制 剂、底物类似物） 被吸附物质结合 竞争性地与 配体结合 Affinity chromatography Competitive elution 8.5.2 模型分析 基于线性推动力速率方程和恒定图式假设推算的总传质系数，预测穿透曲线的。 利用轴向扩散模型描述亲和色谱操作过程 如果亲和吸附平衡关系符合