肌动蛋白的克隆与鉴定.docVIP

β—肌动蛋白的克隆与验证 李亚楠 邹曾阳 孟冠奇 李军 张建忠 沈彤 摘要：Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重骨架蛋白。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。β-Actin是常用的内参，βActin抗体是Western Blot很好的内参指数。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。 本次实验主要通过PCR的手法来扩增目标蛋白。通过组织细胞提取DNA，用琼脂凝胶电泳来验证是否得到目标DNA；回收后的目标DNA 用PCR仪扩增，并用电泳进行回收；与T载体（PUD-18T）连接；用培养的大肠杆菌DH-5a来制备感受态细胞；将制备完成的感受态细胞均匀的涂布于含有x-gal和IPTG的混合液的LB培养基平板中进行蓝白斑的筛选；最后提取质粒DNA，经验证后保藏菌种。 关键词：β-肌动蛋白 横纹肌蛋白质 1材料与方法 1 组织细胞DNA提取。[3] 1.1.1 试剂：细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、TE缓冲液、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、7.5mol/l乙酸铵。 器材：胶头滴管、离心机、烧杯、动物组织、研钵、水浴。 1.1.2 方法 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g，尽量剪碎，置于石英研钵中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K20微升，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴20min，间歇震荡离心管数次。于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。 加2倍体积的异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100微升吸头挑出晾干，用200微升TE重新溶解。 加等量的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）振荡混匀，离心12000rpm 5min。 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/l乙酸铵，加入2倍体积的无水乙醇，混合后室温沉淀2min,离心12000rpm 10min。 小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 用1ml 70％乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000rpm 5min。 小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 加200微升TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。 1.2 PCR扩增 1.2.1 器材：PCR仪、移液枪、上下引物、去离子水、反应缓冲液，模板DNA、组织DNA 1.2.2 方法 在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性（高温使双链DNA解离形成单链。）、退火（低温下，引物与模板DNA互补区结合）、延伸（中温延伸，DNA聚合酶催化引物为起始点的DNA链延伸反应与），体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA 在PCR管中依次加入下列溶液：PCR预混液12.5微升、去离子水9.5微升、上游引物1微升、下游引物1微升、组织DNA1微升。共计25微升体系 设置PCR反应程序： 94℃ 5min 94℃ 30s 58℃ 30s 32个循环 72℃ 1min 72℃ 8min 1.3电泳 1.3.1仪器：水平电泳槽.电泳仪.凝胶成像分析系统.微波炉.微量移液器.透明胶带.点样板.100ml或250ml锥形瓶.量筒.吸头等。 试剂：50x TAE.Tris溶液.冰乙酸.EDTA溶液.去离子水.1xTAE缓冲液.琼脂糖.溴化乙啶贮存液.溴化乙啶.溴酚蓝.二甲苯青.甘油. 其他：DNA样品.DNA Ladder。 1.3.2方法 称取1.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入150ml1xTAE瓶口倒扣小烧杯100℃加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀即成1