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HLA-B27与流式细胞术 一、检测HLA-B27的意义 HLA抗原是人类主要组织相容性复合体（Major Histocompatibity Complex， MHC）的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答的功能。根据HLA抗原结构，功能与组织分布的不同，可分为三类：Ⅰ类分子为HLA-A、-B、-C系列抗原，广泛分布于各组织有核细胞表面，包括血小板和网织红细胞，成熟的红细胞一般不含HLA抗原；Ⅱ类分子为HLA-D/DR、-DP、-DQ系列抗原，主要在B细胞和抗原提呈细胞上表达，这两类抗原都与移植有关，其中Ⅱ类抗原更为重要；Ⅲ类分子为补体成分。 近年来研究HLA与疾病相关性的资料表明，某些疾病的发生率与一些特殊型别的HLA检出率有关，这些病大多是发病机理不明并伴有免疫功能异常和有遗传倾向性的疾病，因此，分析HLA抗原表达情况不仅有助于了解发病机理，对于疾病的诊断、预防和预后判断都有重要意义。 HLA-B27基因属于Ⅰ型MHC基因，基本上表达在机体中所有含核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面有丰富的含量。早在二十多年前，人们就已发现HLA-B27抗原的表达与强直性脊椎炎有着高度相关性，超过90%的强直性脊椎炎患者其HLA-B27抗原表达为阳性，普通人群中仅5-10%的为阳性，而强直性脊椎炎由于其症状与许多疾病相似而难以确诊，因此HLA-B27的检测在病情的诊断中有着重要意义。在脊椎性关节病这一类的疾病中除了强直性脊椎炎以外，还有许多其它的疾病与HLA-B27抗原的表达有着或多或少的相关性，比如说Reiter，s综和症，HLA-B27阳性率为70-90%；银屑病性关节炎，HLA-B27阳性率为50-60%；葡萄膜炎（眼色素层炎），HLA-B27阳性率为40-50%；溃疡性结肠炎伴有关节病，HLA-B27阳性率为5-10%等等，因此HLA-B27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。 二、HLA-B27的检测方法 1．传统方法 常规检测HLA抗原的方法为Terasaki和McClelland提出的微量细胞毒实验，其基本原理是：标准抗血清中含有细胞毒抗体，与待测细胞表面相应的HLA抗原结合，激活随后加入的补体，使细胞损伤或裂解，再利用染料排斥实验，通过显微镜判断受检细胞的活性。抗血清由经产妇提供，为多克隆的，因此其灵敏度和特异性都很难达到100%；再加上需要密度梯度离心来分离淋巴细胞，整个实验过程相当耗时且劳动强度较大；除此之外，它还需要专门的技术人员来诠释实验结果，无法普及。 2．流式细胞术 单克隆抗体和荧光素的开发使得流式细胞仪在各个领域得到空前的发展，多参数同时测定使得流式细胞术得以快速，灵敏，特异地检测某一特定细胞群中某一特异性抗原的表达。与传统方法相比，用流式细胞仪来检测HLA-B27的表达，无须分离淋巴细胞，操作简单，自动化程度高；灵敏度可达100%，特异性达97.4%；结果稳定，样本之间，不同仪器之间，不同实验室之间可重复性高。 BD公司推出的HLA-B27试剂盒与HLA-B27自动软件配套使用，为我们提供了一种快速准确地检测病人T-淋巴细胞表面HLA-B27抗原表达的方法。 试剂盒介绍 Reagent A：Anti-HLA-B27 FITC/CD3 PE，1.5ml 包括FITC标记的抗-HLA-B27（GS145.2），与HLA-B27抗原特异结合，PE标记的抗-CD3（SK7），与人类T淋巴细胞特异结合。 Reagent B：10X Lysing Solution，30ml 使用前，用蒸馏水稀释10倍。 Reagent C：Calibtation beads for FL1，1.5ml 用于调试仪器。 实验原理 将单克隆抗体与外周血共孵育，裂解红细胞，洗涤固定后，上机检测。在检测之前，仪器已经CaliBRITE beads和HLA-B27 calibration beads调试成功，并通过试剂批号的后缀确定了decision marker的位置。 HLA-B27软件首先在FSC-FL2的点图上确定CD3强阳性细胞群体的位置，设定一个CD3+T淋巴细胞门，然后再根据FSC设定光散射门，去除FSC过大或过小的细胞，确保门内至少有50%的CD3+T淋巴细胞，这样通过二者的结合，将随后进行的分析严格地定位在T淋巴细胞上。 注意：HLA-B27单克隆抗体（GS145.2）不仅可与所有已知的HLA-B27亚型结合，还会与HLA-B7发生交叉反应，少数情况下与其他HAL-B等位基因的产物也能结合。由于T细胞只表达HLAⅠ型抗原，所以通过分析T淋巴细胞上的抗-HAL-B27 FITC平均荧光强度，就能最大限度地减少检测假阳性，将HLA-B7或其他交叉