中药仙茅不同有效成分对骨髓间质干细胞诱导作用的比较.docVIP

中药仙茅不同有效成分对骨髓间质干细胞诱导作用的比较 　　【摘要】 目的 比较中药仙茅中不同有效成份对骨髓间质干细胞诱导作用的差异。方法 分别采用RT-PCR检测和倒置显微镜下观察的方法， 对使用中药仙茅多糖和仙茅黄酮诱导刺激后的骨髓间质干细胞进行检测， 观察仙茅不同有效成分对骨髓间质干细胞刺激后的变化。结果 仙茅多糖和仙茅黄酮成分均能诱导骨髓间质干细胞向神经元细胞诱导分化。结论 仙茅黄酮较仙茅多糖对骨髓间质干细胞向神经元细胞定向诱导分化的作用更强。 　　【关键词】 仙茅多糖；仙茅黄酮；骨髓间质干细胞；神经元细胞；神经胶质细胞 　　最近研究表明， 骨髓间质干细胞（MSCs）具有在一定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌母细胞的强大潜能。因此如何诱导骨髓间质干细胞的分化并成功应用于临床成为研究热点。传统中医认为“肾主骨生髓”， 基于几千年中医临床实践， 常以“温肾壮阳， 填精益髓”为治疗原则， 治疗神经系统疾病。前期研究结果证明， 仙茅作为传统温肾壮阳之要药， 其水提物具有明确促进骨髓间质干细胞向神经细胞转化的作用， 但其作用核心有效成分或单体成分是什么尚属空白。本研究选择仙茅中多糖类和黄酮类两大主体成分， 分别对成年大鼠骨髓间质干细胞体外转化为神经细胞进行研究， 并比较两类成分作用的差异性， 为进一步的有效单体成分研究及后期临床应用奠定实验基础。现将研究结果报道如下。 　　1 材料与方法 　　1. 1 试验材料和试剂 选用2月龄SD大鼠， 体重180～200 g， 雌雄各3只（由成都中医药大学试验动物中心提供）；仙茅多糖、仙茅黄酮提取物（由成都中医药大学药学院提供， CO60照射消毒）；胎牛血清（中美兰州民海生物公司）；胰酶 （美国Amresco公司 ）；改良伊格尔髙糖培养基（DMEM）（美国Gibco公司）；二甲基亚砜（DMSO）（美国Gibco公司纯度99.5%）；青霉素（成都制药一厂， 批；链霉素（成都制药一厂， 批；D-Hanks平衡盐溶液（美国Hyclone公司）；TriZol 试剂（美国Invitrogen公司）；PCR引物[NSE 、GFAP， 宝生物工程（大连）有限公司， 引物序列及产物大小见表1]；25 cm2塑料培养瓶、6孔板（美国Orange公司）。 　　1. 2 试验方法 　　1. 2. 1 大鼠MSCs的分离与培养 无菌条件下取出大鼠股骨， 剪去股骨两端， 用含10%DMEM培养液冲洗骨髓腔， 反复离心洗涤后， 收集骨髓细胞悬浮液， 接种在培养瓶中， 37℃、5%CO2培养。24小时和48小时后， 完全换液， 去掉未贴壁的细胞， 以后每隔3天半量换液。10～14天细胞接近融和， 0.125%胰酶消化传代。 　　1. 2. 2 定向诱导MSCs向神经元分化 细胞RT-PCR样本的制作：将第3代的骨髓细胞经记数调整细胞密度为1×105/ml， 接种于6孔培养板中， 每孔加细胞悬液3 ml。在培养箱中培养24 h， 随机分组为仙茅多糖组、仙茅黄酮组、阳性对照药物组——二甲基亚砜（DMSO）和空白组， 各2孔， 先移去1.5 ml培养液， 仙茅多糖组、仙茅黄酮组、阳性对照药物组分别加入由10%DMEM配置的1%仙茅多糖提取液、0.1%仙茅黄酮提取液、4%DMSO各1.5 ml， 空白组加入10%DMEM1.5 ml。持续刺激72小时后。0.125%胰酶消化下细胞送检。 　　1. 2. 3 诱导细胞鉴定 　　1. 2. 3. 1 RT-PCR检测 以神经细胞的标志性蛋白—神经元烯醇酶（（NSE）和星形胶质细胞的标志性蛋白—胶质纤维酸性蛋白（GFAP）检测其mRNA的表达。 　　1. 2. 3. 2 倒置显微镜下观察 分别于加药前和加药后， 在倒置显微镜下观察细胞形态的改变。 　　2 结果 　　2. 1 RT-PCR检测对mRNA半定量测定结果 经测定， 4样本中均有NSE和GFAP表达。仙茅多糖组样本、仙茅黄酮组样本中NSE的mRNA表达明显高于空白样本， 仙茅黄酮组样本NSE表达接近DMSO样本， 但仙茅多糖组样本明显低于DMSO样本。仙茅多糖组样本中GFAP的mRNA表达量明显高于其余3组样本， 而仙茅黄酮组样本中GFAP的mRNA表达量明显低于其余3组样本（结果见表2、3）。 　　2. 2 倒置显微镜小观察结果 仙茅多糖组样本、仙茅黄酮组样本和DMSO样本在诱导48小时后， 卵圆形细胞明显减少， 72小时后可见大量神经元样细胞出现， 其触突明显长出。胞体较大， 细胞核大而较为透明， 有较为明显的细胞核， 核/质较大， 有长的触突生长。而空白对照样本物变化较小。 　　3 讨论 　　通过此次试验， 我们可以得到三个