α平滑肌肌动蛋白红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达.docVIP

α平滑肌肌动蛋白红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达 　　[摘要] 目的 构建α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体，为研究细胞内α-SMA的基因表达调控提供重要工具。 方法 克隆并构建含α-SMA启动子区的红色荧光报告质粒pDsRed-SMAp；用脂质体瞬时转染上皮细胞A549，观察α-SMA启动子对转化生长因子（TGF-β1）刺激的反应。 结果 酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是pDsRed-SMAp重组载体；该表达载体在上皮细胞静息状态下表达水平很低，经TGF-β1刺激后，在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。 结论 成功构建了α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp，对生理相关刺激有很好的反应，可有效地用于α-SMA基因表达调控机制的研究。 　　[关键词] α平滑肌肌动蛋白；红色荧光蛋白；载体构建 　　[中图分类号] Q95-3；R563 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（a）-0007-03 　　特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibros，IPF）是一种慢性弥漫性肺间质疾患，发病原因不明，组织学表现为寻常型间质性肺炎（usual interstitial pneumonitis， UIP）[1]。IPF是最常见的特发性间质性肺病，预后差，生存中值只有4年[1-3]。IPF主要发病人群年龄为50～70岁，分布没有人种易感性，男性年发病率为7/10万，女性年发病率为11/10万[4]。IPF的组织学特征包括：肺泡上皮细胞不均一性的损伤活化、特征性的成纤维细胞灶存在和大量细胞外基质沉积[5]。虽然目前对其发病机制有一定的认识，但是其病因和具体的细胞分子机制还未明了。值得注意的是，肺纤维化目前还缺乏有效的治疗手段，患者最后的转归均为呼吸衰竭和死亡。 　　成纤维细胞灶的形成是IPF关键的病理改变，其主要效应细胞是成肌纤维细胞[6]。目前大多数学者认为，损伤的肺泡上皮细胞通过上皮细胞-间质转分化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是肌纤维细胞的主要来源[6]。EMT的过程表现为上皮细胞标志物的消失，转而表达间质细胞标志蛋白α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）[7]。 　　α-SMA基因表达的异常激活与调控在肺泡上皮细胞向成肌纤维细胞转分化的过程中占有极为重要的地位，在EMT过程中细胞如何启动和调控α-SMA 基因的表达尚未明了。为了探讨肺泡上皮α-SMA基因在肺纤维化微环境下的转录激活，本课题组构建了由α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告载体，并在肺泡上皮细胞中进行表达和定位。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂和仪器 　　人肺泡上皮细胞A549细胞株、大肠杆菌DH5α、VSMp8质粒（含小鼠α-SMA启动子序列）由本校实验室保存；质粒微量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒（优晶公司）；红色荧光蛋白报告质粒空载体pDs-Red（Clontech公司）；限制性核酸内切酶（宝生物公司）；Lipofactine 2000 转染试剂（Invitrogen公司）；重组人TGF-β1（RD公司）；倒置荧光显微镜（德国Leica公司）；凝胶成像系统（美国Kodak公司）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 α-SMA启动子红色荧光报告载体pDs-Red-SMAp的构建 已知α-SMA启动子区是插入在质粒VSMp8多克隆位点BamHⅠ和sphⅠ之间，用BamHⅠ和sphⅠ内切酶酶切VSMp8得到启动子序列，将其插入pGEM-7Zf质粒的BamHⅠ和sphⅠ位点之间；然后用BamHⅠ和ApaⅠ内切酶酶切再次得到α-SMA启动子序列；继而将启动子序列亚克隆于pDs-Red的BamHⅠ和ApaⅠ位点之间；最终得到重组质粒pDsRed-SMAp。重组子经BamHⅠ和ApaⅠ双酶切鉴定、测序鉴定无误后，扩增备用。 　　1.2.2 细胞培养 A549细胞株培养在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中，常规培养于5%的CO2、37℃人工培养箱。 　　1.2.3 质粒转染 转染前1天，将A549细胞以1.5×104/mL细胞密度接种于24孔板，待24孔培养板中细胞融合至70%～80%时，依照Lipofectine 2000转染试剂的操作指南进行转染。 　　1.2.4 实验分组和TGF-β1刺激 实验分为4组，A组：转染对照空载体质粒pDsRed组；B组：转染对照空载体质粒pDsRed + TGF-β1组；C组：转染重组质粒pDsRed-SMAp组；D组：转染重组质粒pDsRed-SMAp+T