人心房利钠肽对机械通气肺损伤大鼠肺组织NF—κB p65表达的影响.docVIP

人心房利钠肽对机械通气肺损伤大鼠肺组织NF—κB p65表达的影响 　　[摘要] 目的 探讨人心房利钠肽（hANP）对大鼠机械通气性肺损伤（VILI）时炎症因子和NF-κB p65表达的影响。 方法 采用高气道压机械通气模式制备VILI模型。雄性SD大鼠30只随机分为空白对照组（TV组）、机械通气肺损伤组（HV组）和人心房利钠肽组（HV+hANP组）。HV+hANP组于机械通气30 min后静脉注射hANP 0.1 g/（kg·min），机械通气4 h时处死大鼠。免疫蛋白印迹法测定肺组织NF-κB p65的表达；酶联免疫吸附法测定肺组织TNF-α和IL-lβ的含量；计算肺组织湿/干重比（W/D）。 结果 与TV组相比，HV组、HV+hANP组肺组织TNF-α[（519.22±35.31）、（283.54±24.16）ng/L]和IL-lβ[（751.82±65.35）、（316.29±25.65）ng/L]含量明显上升（P 0.05），NF-κB p65[（238±24）、（178±14）]表达明显增加，肺组织W/D[（9.7±1.2）、（6.4±0.9）]明显升高（P 0.05）；与HV组相比，HV+ hANP组肺组织TNF-α和IL-lβ含量明显降低（P 0.05），NF-κB p65表达明显抑制，肺组织W/D降低（P 0.05）。 结论 hANP通过抑制肺组织NF-κB p65表达，减轻肺部炎症反应，从而减轻大鼠机械通气所致肺损伤。 　　[关键词] 人心房利钠肽；机械通气肺损伤；NF-κB p65 　　[中图分类号] R563.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）12（b）-0014-03 　　在急性肺损伤或者呼吸衰竭等危重症的救治中，机械通气是影响患者预后的重要措施，但笔者发现它本身可诱发或加重肺损伤，即机械通气所致肺损伤（VILI）[1-2]。人心房利钠肽（ANP）一种活性多肽，具有利钠、利尿、扩张血管、调节体液平衡、抑制炎性介质释放等多种作用[2]。本研究拟观察机械通气损伤大鼠肺组织NF-κB、肺水含量及相关细胞因子表达的改变，探讨ANP对VILI的治疗作用及其机制。 　　1 材料与方法 　　1.1试剂 　　人心房利钠肽（批号：S21535-312，Sigma公司，德国）；大鼠TNF-α及IL-lβ ELISA检测试剂盒（ADL公司，美国）；核蛋白抽提试验盒（上海迪奥生物科技有限公司，中国）；NF-κB P65多克隆抗体（Santa Cruze公司，美国）。 　　1.2 动物分组与模型制备 　　湖北医药学院实验动物中心提供Wistar大鼠30只，随机分为三组：空白对照组（TV组，潮气量8 mL/kg）、机械通气肺损伤组（HV组，潮气量40 mL/kg）、人心房利钠肽组（HV+hANP组）。HV+hANP组于高容量机械通气30 min后静脉注射hANP[0.1 g/（kg·min）]，TV组和HV组于相同时间静脉注射等体积生理盐水。 　　模型制备：由左股静脉穿刺置管建立通道，进行输液，给药，并经此通道间断注射肌松药阿曲库铵维持大鼠肌肉松弛。常规消毒后，颈部正中切开气管，将气管导管经此插入，连接小动物呼吸机（HX-300，成都泰盟科技有限公司），行机械辅助通气，吸入气体为空气，呼吸频率设置为40 次/min，吸呼比为1∶1。机械通气4 h时静脉注射氯化钾处死大鼠。 　　1.3 标本采集及检测 　　1.3.1 肺组织核蛋白提取及定量 取右下肺叶肺组织约100 mg，充分洗涤，按照试剂盒说明，在组织样本中加入蛋白抽提试剂A-MIX，置玻璃均浆器冰上匀浆30～50次，时间约为2 min。将匀浆液转移至冷的离心管中，4℃于3000 r/min离心10 min，弃去沉淀，收集上清。将匀浆上清液转移到离心管中，加入蛋白抽提试剂A-1，于漩涡混合器中震荡20 s，于4℃保持10 min， 3000 r/min 4℃离心10 min，弃上清。取蛋白抽提试剂B-MIX 100 μL加入离心管中，于漩涡混合器中震荡20 s，于4℃保持30 min，14 000 r/min于4℃离心2 min，上清转至新管中，为核蛋白。采用Bradford比色法测定核蛋白浓度，调节为0.5～1.0 μg/μL，放置-70℃冷冻保存。 　　1.3.2 免疫蛋白印迹法（Western blot）测定NF-κB P65的表达 严格按照Western blot步骤及要求操作。蛋白定量后，各组分别取20 μg总蛋白，经10% SDS分离、转膜和脱脂奶粉4℃封闭过夜，一抗为NF-κB P65多克隆抗体，孵育过夜，洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）（1∶5000稀释），常温孵育1