第二章 基因工程工具酶课件.ppt

造成位点偏爱现象的原因 限制酶在切割DNA之前需要同时与两个识别位点作用； 限制酶对要求作用的DNA序列有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA切割时激活另一个的变构位点。 一、定义 二、限制性内切酶的发现 三、限制修饰系统的种类 四、限制性内切酶的命名 五、限制酶的特点 六、酶切反应条件 七、限制酶的星星活性（star activity） 八、限制酶的用途 对任意一个限制酶来说，都有其各自的最佳反应条件。 缓冲液 反应温度 反应时间 酶切反应的终止 一、定义 二、限制性内切酶的发现 三、限制修饰系统的种类 四、限制性内切酶的命名 五、限制酶的特点 六、酶切反应条件 七、限制酶的星星活性（star activity） 八、限制酶的用途 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 实际上星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。 引起星星活性的因素 甘油浓度高（5%） 限制酶过量（100U/?l） 离子强度低（25mM） pH 值过高（8.0） 反应体系含DMSO、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等有机溶剂 Mg++ 被其它二价阳离子如 Mn++ 、Cu++、Co++ 或 Zn++ 代替 抑制星星活性的措施 减少酶的用量（可避免过分酶切） 减少甘油浓度 保证反应体系中无有机溶剂或乙醇 提高离子强度到 100～150mM （但不能抑制酶活性） 降低反应 pH 至 pH7.0 保证使用 Mg++ 作为二价阳离子 一、定义 二、限制性内切酶的发现 三、限制修饰系统的种类 四、限制性内切酶的命名 五、限制酶的特点 六、酶切反应条件 七、限制酶的星星活性（star activity） 八、限制酶的用途 DNA重组 限制酶（物理）图谱绘制 突变分析（RFLP分析） 限制酶的部分酶切与完全酶切 第二节? 甲基化酶 （Methylase） 一、甲基化酶的种类与识别序列 二、甲基化对限制酶切的影响 原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。 1.???? 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶 三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤。 在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。 M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 M．HpaI C mCGG HpaI C CGG 相同 2. E.coli 的dam、dcm甲基化酶 这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。 Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。 G mATC Dcm 甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。 C mCAGG C mCTGG 该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。 3. 哺乳动物的甲基化酶 E.coli 中至少有 3 种依赖于甲基化的限制系统 mcrA、 mcrBC 和 mrr ，它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列，都降解由 CpG 甲基化酶（M SssⅠ）作用的 DNA 。 4. E.coli中依赖于甲基化的限制修饰系统 一、甲基化酶的种类与识别序列 二、甲基化对限制酶切的影响 1．修饰酶切位点 M.TaqⅠ 处理 DNA 后， GTCGAC 将不受 HincⅡ 切割。 GTCGAC GTCAAC GTTGAC GTTAAC HincⅡ M.TaqⅠ TCGA 2．产生新的酶切位点 DpnⅠ 是依赖甲基化的限制酶， TCGATCGA 受 M.TaqⅠ 处理后形成甲基化（A）产物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即为 DpnⅠ 位点。 第三节? DNA 聚合酶 （DNA polymerase ） DNA聚合酶指的是在DNA(或RNA)模板指导下，以4种dNTP为底物，在引物3’-OH末端聚合DNA链的一类酶。 特点： ① 需模板(DNA或RNA) ② 需引物 ③ 聚合方向5′→3′ ④ 同时具有3′→5′和外切5′→3′外切作用 目前已开发的DNA聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ(全酶)(E.coli) Klenow片段(E.coli) T４DNA聚合酶 T７DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶(耐热) DNA末端转移酶(小牛胸腺) 反转录酶(依赖RNA)聚合酶