EPO对大鼠皮肤切创愈合过程中VEGF变化影响及其与剂量、时间的相关性.docVIP

EPO对大鼠皮肤切创愈合过程中VEGF变化影响及其与剂量、时间的相关性 　　【摘要】目的探讨重组人促红细胞生成素（LHEPO）对大鼠皮肤切创形成的急性创面愈合的影响。方法 健康SD雄性40只大鼠建立急性创面动物模型，随机分成低剂量组（50U/ LHEPO），中剂量组（100U/LHEPO），高剂量组（150U/LHEPO）和生理盐水（NS）对照组， 造模同时进行外敷不同剂量LHEPO及生理盐水治疗。观察每组大鼠创面愈合情况，并于伤后 3d， 7d ，14d取创面皮肤标本，免疫组织化学方法染色检测创面VEGF的变化。结果与对照组比，治疗7d后，中和高剂量LHEPO组大鼠创面愈合率均显著增加（P 0.05）；疫组化结果为血管内皮生长因子（VEGF）在高剂量和中剂量药物治疗组皮肤组织中高表达，在同一时间点与对照组有显著性差异（P0.05）。结论LHEPO能促进大鼠皮肤切创愈合创面微血管形成，加速创面愈合。 　　【关键词】促红细胞生成素；血管内皮细胞生长因子；创面愈合 　　【中图分类号】 R64 【文献标识码】A【文章编号】1004-4949（2013）07-194-02 　　创伤修复是一个涉及多种细胞及其产物协同对细胞外基质进行重建和再生的过程，在这一过程中， 新生组织的生成必须依托于新生血管的生成， 才有可能促进创面快速愈合。目前已知作用于造血系统的促红细胞生成素（ EPO）也能在体内诱导新生血管的形成，具有较强的促血管生成的活性。本实验旨在通过大鼠建立急性创面动物模型，探讨重组人促红细胞生成素（LHEPO）对对大鼠皮肤切创形成的急性创面愈合的影响，为创面修复寻找新的用药及治疗途径提供理论依据。 　　1材料与方法 　　1.1 主要药品： 　　重组人促红素注射液（北京四环生物制药有限公司，批号；生理盐水（杭州民生药业有限公司，生产批号。 　　1.2 动物急性创面模型制作及分组： 　　雄性SD 大鼠40 只，体重200-220g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK（辽）2010-0001。SD大鼠于术前一天臀背部剃毛。10%水合氯醛以3.5ml/kg 的剂量腹腔注射麻醉， 在无菌条件下进行皮肤切创造创手术：常规手术消毒，在大鼠背部近臀部以脊柱为中心，做一个直径大约为2.5cm 的创面，切除皮肤达肌肉筋膜层，形成急性创面，将造模后40 只SD 大鼠随机分成四组，即模型组，重组人促红素注射液低剂量组、中剂量组和高剂量组，生理盐水对照组，每组10 只。造模同时进行外敷不同剂量重组人促红素注射液及生理盐水治疗。各组大鼠每天创面用无菌生理盐水进行清理后，创面分别均匀湿敷 50U/mL、100 U/mL、150U/mL 重组人促红素注射液及生理盐水，每日1 次，每次1mL，于伤后14 d 停止给药。观察每组大鼠创面愈合情况，并分别在3d，7d，14d 取材检测指标。 　　1.3 观察创面愈合率：每日拍照，游标卡尺测量： 创面愈合面积率=（原始创面面积-残余创面面积）/原始创面面积× 100% 　　1.4血管内皮生长因子（VEGF）检测： 　　采用免疫组化方法检测VEGF表达。石蜡切片（4μm）常规脱蜡，逐级水化，先经3 H2O2室温下灭活内源性过氧化物酶活性20min，0.01 mol/L枸缘酸缓冲液行抗原修复，然后依次加入正常小牛血清（1：10）、VEGF（1：100）、生物素标记的兔抗鼠抗体、生物素标记羊抗兔抗体（1：200）、SP复合物 （1：200）。各步骤之间均经37。C恒温箱孵育3Omin，PBS冲洗（小牛血清除外），最后DAB染色，苏木索复染，树脂封片。用PBS代替一抗作为空白对照。胞浆有棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞。 　　在400倍镜下，随机选取10个左右阳性表达视野，进行染色结果判断：①根据着色的强弱对染色强度进行评分，0 分为无着色；1 分为淡黄色、略高于背景；2 分为棕黄色、明显高于背景；3 分为强染、着棕褐色；②根据阳性细胞百分数对染色强度进行评分，0～2 分为阴性（-）；3～4 分为弱阳性（+）；5～6 分为阳性（++）；7 分为强阳性（+++）。两者相加为免疫组化评分，取其平均值作为阳性表达量。 　　1.5数据统计：实验结果均以平均值±标准差（x±s）表示，各组间均数比较用t 检验处理，以P 0.05 为差异具有显著性。 　　2结果 　　2.1创面愈合面积率检测：结果显示，与对照组比，治疗7d后，人促红素注射液中和高剂量组大鼠创面愈合率均显著增加（P 0.05）。 　　2.2各组VEGF表达量： 　　免疫组化结果：血管内皮生长因子（VEGF）在高剂量和中剂量药物治疗组皮肤组织中高表达，在同一时间点与模型组有显著性差