SDS-聚丙烯酰胺凝胶课件.pptVIP

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 一.什么是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳? 1.聚丙烯酰胺凝胶: 由丙烯酰胺单体(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis) 在催化剂过硫酸铵(AP) 或核黄素,以及加速剂四甲基乙 二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构凝 胶. 形成的凝胶具有稳定的亲水性,无电离基团,不带电荷, 几乎无吸附和电渗作用.凝胶孔径可控制. *凝胶机械性能和孔径大小: 由总浓度T% 控制. 即100ml凝胶溶液中含有Acr、Bis的总克数. T%越大,平均孔径越小,机械强度大. 交联度C%: Acr和Bis的比例. 即交联剂Bis占单体Acr与Bis总量的百分数. * 分子量范围 适用的凝胶浓度(%) 蛋 白 质 ?104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸 ?104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 2.SDS: 十二烷基磺硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS) 阴离子去污剂在水溶液中以单体（monomer）和分 子团（micellae）的混合形式存在. 破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非 共价键，使蛋白质变性(denature)而改变原有的构象， 保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋 白质-SDS复合物。 聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物,电泳系统中加 入一定浓度的SDS称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS). SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于蛋白质的 分离、蛋白质或肽类分子量的测定. 二.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理: SDS与样品中各蛋白质形成的SDS-蛋白质复合 物带有大量的负电荷,从而使天然蛋白质分子间的 电荷差别降低或减至最小,与此同时蛋白质在SDS 作用下结构变得松散，形状趋向一致使被测物的 泳动速率的大小完全取决与该物质的分子量. (一)蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和 强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决 于亚基分子量的大小,而电荷因素可以被忽略。 1.SDS 阴离子去污剂, 变性剂, 助溶剂. 断裂分子内和分子间的氢键,分子去折叠, 破坏蛋白质分子的二级和三级结构. 2.强还原剂 a.β-巯基乙醇 b.二硫苏糖醇(DTT) 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂. SDS和还原剂的作用： （1）分子被解聚 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带 负电荷的蛋白质-SDS胶束。 （3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超  过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了 不同分子之间原有的电荷差异 蛋白质-SDS胶束的特点 （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的. （3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比. 胶束在SDS系统中的电泳迁移率不再受蛋 白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度， 即蛋白质或亚基分子量的大小。  当蛋白质的分子量在15KD—200KD之间时，电泳 迁移率与分子量的对数呈线性关系. *不同的蛋白质分子有不同的电泳迁移率mR，自由迁移 率m0和阻滞系数KR值 不同蛋白质的SDS复合物的m0值都很接近，分子量相 差5倍的蛋白质之间，m0值只相差10%，如果忽略这个差 别,就可以认为，各种蛋白质-SDS复合物的m0基本上是 一个定值。这表明，不同蛋白质的SDS复合物都带有相 同密度的负电荷，并具有同样的构象它们的净电荷量与 摩擦系数(f由溶液的粘滞性、蛋白质分子的大小和形状决 定)之比（q/f）都接近于一个定值而不受各种蛋白质原来