实验室分子生物学实用验基本操作规范及注意事项.docxVIP

实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项一、酶与载体的分装酶类与载体：T载体(50 ng/μl)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/μl）后分装成10 μl或20 μl；连接酶（solutionΙ）按5 μl分装；dNTP（10 mM） 分装成50 μl；无菌水分装成1 ml；注意：（1）所有分装都必须用已灭菌的管。（2）所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。 （3）工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。 （4）当你发现你使用的是最后一管（盒）公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。 （5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。每人负责六个月。其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。二、常见抗生素及IPTG的配置以氨苄青霉素为例：1．准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 ml的离心管、0.22 μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。3．称取2 g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。4．用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml的离心管中。注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。5．把100 ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管0.5 ml。在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。6．把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度名称储存浓度工作浓度氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/ml50 μg/ml～100 μg/ml卡那霉素（kanamycin）10 mg/ml10 μg/ml～50 μg/ml氯霉素（chloramphenicol）25 mg/ml12.5 μg/ml～25 μg/ml链霉素（streptomycin）50 mg/ml10 μg/ml～50 μg/ml四环素（tetracyyline）10 mg/ml10 μg/ml～50 μg/mlIPTG1 M0.05-0.6 mM三、分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制参见《分子克隆》。四、总DNA的提取具体步骤参考试剂盒说明书。注意：革兰氏阳性菌DNA提取时需要加溶菌酶。五、基因扩增1． 引物与合成：设计引物序列，发至生工公司进行合成（mailto:jinan@jinan@）。2．引物配制：合成后的引物先离心至管底，然后按说明书用无菌水稀释至10-50μM，分装至无菌EP管中，做好标记（一定要标记浓度！）后，于-20度保存备用。3． PCR反应体系配制：将所需各组分在冰浴中化开后，进行PCR反应体系配制。反应体系及反应参数按不同聚合酶的说明书进行，以transgen 的easyTaq酶扩增1kb基因序列为例，100 μl反应体系为：10×buffer 10 μl，dNTP (10 mM) 2 μl,引物各2 μl （10-50μM），模板1 μl（根据浓度加减体积），Taq酶1 μl，ddH2O 82 μl（注意：加入顺序为：水，buffer，dNTP，引物，模板，酶）。涡旋混匀，分装至四-五管，瞬时离心。注意：若反应时间较长在反应混合液的上层加10-20 μl 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发。4． 将管放入PCR仪中，在PCR仪上设置好PCR反应参数， 例如：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 sec，Tm 55℃ 1 min， 72 ℃ 2 min，72 ℃ 10 min，16 ℃ 1 h,一般设30个循环。待温度降至16 ℃后停止PCR仪，尽快取出样品，不允许过夜。六、琼脂糖核酸电泳1. 电泳缓冲液的配制：电泳缓冲液一般为TAE（或TBE）,其配制方法参见表2，先配制50×母液放于4度冰箱中，电泳时稀释100倍使用。2. 将制胶模具和梳子冲洗干净，架好梳子；3. 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶 （表3）：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液；放入到微波炉内加热至胶粒全部熔化(一般沸三次即好),冷却片刻，倒入制胶模具中，待其凝固；室温下30-45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1 mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；在DNA样品中加入1/5-1/10体积的上样缓冲液（1% SDS,