植物的原生质体培养..pptVIP

植物的原生质体培养 主要内容 ?原生质体的概念 ?原生质体培养的优越性 ?原生质体的分离 ?原生质体的培养 原生质体(protoplast)： 指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露球形细胞。 细 胞 一、植物原生质体的特点： 1、吸收能力增强：易于摄取外来遗传物质、细胞器、细菌、病毒等；易于吸收氧、养分； 2、具有全能性：具有全套的遗传物质，具有细胞壁再生并能进行人工培养分化发育成完整植株的能力； 3、在一定条件下可诱导原生质体融合，形成杂种细胞 。 4、分泌能力提高: 去除了细胞壁的扩散障碍，使细胞膜的透过性增强，利于胞内产物的分泌。 5、稳定性较差: 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易于受到渗透压等条件变化的影响。 原生质体用途 二、 原生质体的制备 不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不一样。 1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛的细胞，幼嫩的组织。 ?无菌试管苗叶片 ?上胚轴和子叶 ?培养细胞（愈伤组织） 2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理 1）机械法 ? 1892年首先用于藻类分离原生质体 ? 做法：先使细胞质壁分离，再用刀把细胞壁切破，使原生质体流出或释放出来。 ? 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。 ? 缺点： 1) 手工操作难度大，原生质体得率低，费时费力，难以大量制备。 2）能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。 2）酶解法 ? 1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番茄幼苗根尖中大量制备出原生质体； ? 常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗牛酶等； ? 优点：条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。 ? 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的活力。 ?酶解制备原生质体过程 ? 1)、取材预处理 ? 2)、酶解制备 ? 3)、原生质体收集 A、酶溶剂及其渗透压 ?酶的种类 ?酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制、PH値。 ?渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 B、酶解时间：酶浓度及温度。 3）原生质体分离过程：一步法（以烟草叶片为例） 第一步：预处理即对烟草植株限制供水 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外表皮切成4cm的小块 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6 第四步：将小块烟叶放入混合酶液25 ℃处理8~10小时 第五步：过滤、离心、洗涤（ 0.7 mol甘露醇液含0.1 m mol CaCl2 ）。如此2~3次、得原生质体 3、原生质体的收集和纯化： 1）离心沉淀法 筛网过滤（400目）除去未消化的细胞、细胞团和碎片后在适当试剂（甘露醇）内低速离心。 优缺点： ? 比较简单 ? 但不易除尽一些完整的细胞，或引起原生质的破碎 2）飘浮法 据原生质体比重小能在一定渗透压的溶液（如25%的蔗糖）中漂浮得到收集。 优缺点： 可以得到较为纯净、完整的原生质体。 但完好的原生质体数量较少。 3）沉淀法和飘浮法结合 先沉淀后漂浮，重复操作，纯化后可用于培养或细胞融合。 4）接口法（界面法） 采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两液相的界面之中，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间。 优缺点： 可以收到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。 ?目的：检验获得的原生质体是否真正的原生质体 ?鉴定方法(针对有无细胞壁)： 5、原生质体活力检测 ?染色法 ? FDA法：FDA（二乙酸荧光素）能穿越细胞质膜，被活细胞内的酯酶裂解，在荧光显微镜下发荧光（荧光素）。 ?伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，但质膜受到严重损坏使细胞被染色。 ?胞质环流法：是否存在胞质环流判