生化实验四--乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白课件.pptVIP

乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白 药学1102班 三组 一 实验目的 1.学习区带电泳的原理 2.掌握乙酸纤维素膜电泳操作技术 二 实验原理 》电泳：带有电荷的颗粒在电场中向与其电性相反的电极移动 》蛋白质分子是两性电解质，由于解离基团的差异，不同的蛋白质具有不同的等电点 》血清中含有数种蛋白质，在pH8.6的缓冲溶液中电泳，在同一电泳中涌动的方向和速度不同，从而使蛋白质混合样品得以分离 》电泳后，将薄膜取出，经染色和漂洗，可得到背景无色的各蛋白质电泳图谱。 》各蛋白质含量可用光密度计直接测定，或用洗脱法进行比色测定 三 器材与试剂 器材 电泳仪、电泳槽、微量注射器或微量吸管、载玻片、滤纸、竹镊子、培养皿、纱布、可见光分光光度计、乙酸纤维素薄膜、血清。 巴尔妥-巴尔妥钠缓冲液 染色剂 （取氨基黑10B 0.5g，加蒸馏水40ml，甲醇50ml和冰乙酸10ml混匀，可重复使用。） 漂洗液 （乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml混匀。） 透明液 （无水乙醇70ml，冰乙酸30ml混匀。） 浸出液 （0.4mol/L的NaOH溶液） 四、实验步骤 乙酸纤维素薄膜点样图 7、如要对血清各蛋白进行定量测定可采用下列方法。 （1）洗脱法 取试管5支，标号，分别加入0.4mol/L的NaOH溶液4.0ml。 将实验步骤四漂洗干净的薄膜用滤纸吸干，剪下各种蛋白质色带，分别放入各试管中，振荡约10min。 待色泽完全浸出后，以0.4mol/L的NaOH溶液为对照，与620nm处测得各管的吸光度，分别记为A清、Aα1、Aα2、Aβ、Aγ。 各种血清蛋白的相对百分含量为： 个别蛋白质的A620值 所有蛋白质A620值总和 （2）光密度法 将步骤5中透明处理的薄膜用光密度计直接测定（数值参考书p29） 注意事项 1、乙酸纤维素薄膜一定要完全浸透，如有任何斑点、污染或划痕，均不能使用。浸泡后的乙酸纤维素薄膜取出后用滤纸吸去其表面的缓冲液即可，不可吸得过干。 2、搭在阴阳两极上的薄膜应完全和盐桥接触。多个膜条进行电泳时，相邻膜之间应留有间隙，不能相互接触。 3、使用血清点样器直接在薄膜上进行血清点样，同样可以获得很好的效果。 4、电泳时间的长短，应以血清各组分最佳分离效果为标准，一般是在以移动最快的血清清蛋白距阳极约1cm处停止电泳。 电泳仪和电泳槽 使用方法 1.用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，不要将正负极接反。　 2.电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。 3.接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电泳终止时间，此时电泳即开始进行。 4.工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拔出电泳插头。 注意事项 1. 禁接触电极、电泳物及其它可能带电部分，不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触电。 2. 不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。 3不超过仪器额定电流时可以多槽关联使用，不能超载。 4. 特殊情况需检查输入情况时，允许稳压下空载开机，但在稳流下必须先接好负载再开机 5. 较大噪音、放电或异常气味，须立即切断电源 * * 试 剂 将乙酸纤 维素薄膜切成 8cm×2cm 条状 把薄膜 浸入PH8.6的 巴比妥— 巴比妥钠 缓冲液 完全浸透后， 竹镊子取出 薄膜， 无光泽面朝上， 平铺在滤纸上 用另外一张滤纸 轻压吸缓冲液 吸取2~3μl血清 涂在载玻片一端 截面处 距膜一端 1.5cm 处相接触 样品呈直线状涂于薄膜上 血清渗入薄膜内 移去玻片 把薄膜 浸入PH8.6的 巴比妥— 巴比妥钠 缓冲液 完全浸透后， 竹镊子取出 薄膜， 无光泽面朝上， 平铺在滤纸上 用另外一张滤纸 轻压吸缓冲液 吸取2~3μl血清 涂在载玻片一端 截面处 距膜一端 1.5cm 处相接触 样品呈直线状涂于薄膜上 血清渗入薄膜内 移去玻片 样品呈直线状涂于薄膜上 血清渗入薄膜内 移去玻片 样品呈直线状涂于薄膜上 血清渗入薄膜内 移去玻片 薄膜点样面向上 点样端置于阴极端 平贴在 电泳槽支架上 薄膜两端分别 用四层纱布 建盐桥 纱布盐桥浸入 两极电泳缓冲液中 盖上盖子， 使薄膜充分浸润 调节电压电流 待样品泳动 距点样处4.5~5cm 时关闭电源 薄膜浸于染色液中 染色5~10min, 用漂洗液漂洗4~5次 每次约5min 背景无色时 浸入蒸馏水中 漂洗后吹干 浸入透明液中 约20min 取出， 平贴于干净 玻璃板 干燥 得背景透明的 电泳图谱