液相色谱原理与方法课件.ppt

液相色谱原理与方法 液相色谱分离原理 液固（吸附）色谱 液液（分配）色谱 键合相色谱 正相色谱 反相色谱 离子对色谱 离子抑制色谱 离子交换色谱 空间排阻色谱 亲和色谱 吸附色谱 分离机理： 化合物在固定相表面吸附中心的竞争吸附，是物理吸附（表面吸附）。流动相分子和样品分子竞争性吸附在固定相的特定位点上，该吸附是可逆的。 吸附色谱 吸附色谱流动相 常使用烷烃为底剂，加入适当的极性调整剂。溶剂极性越大，洗脱能力越大。 注意：不能使用含水的流动相，因为硅胶遇水会失活。（微量水可改善拖尾状况，有时用水作减尾剂） 吸附色谱的分离机理 吸附色谱 分离物质 对中等分子量的油溶性样品可获得最佳分离，例如油品、脂肪、芳烃等 对具有不同极性取代基的化合物或异构体有较好的选择性 但对于强极性或离子型的化合物会产生不可逆吸附。 对同系物分离能力较差 优点：样品负载能力大 稳定性好（pH＝3－8） 液液分配色谱 分离原理 被分离的组分在流动相和固定相中的溶解度不同进行分离。该过程是一个分配平衡过程。 固定相：惰性载体（担体）上机械涂布固定液 固定液容易流失，导致保留值减小，柱效下降。 化学键合固定相已经逐步取代了液液色谱固定相 分配色谱的分离机理 键合相色谱－键合相使用的注意点 1、稳定性 正相键合相的稳定性要小于反相键合相 反相键合相使用PH为2－7.5，PH7.5会引起基体硅胶溶解 2、重现性 同一种类型的键合相，因厂家不同、、生产批号不同，会 表现不同的分离特性，表现为重复性差 3、键合相色谱柱的再生 吸附、缔合等作用使柱效降低 正相色谱柱再生： 1:1甲醇-氯仿 反相色谱柱再生：甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、0.01mol/L 无机酸（硫酸pH2） 键合相色谱－流动相的选择 键合相色谱－正相色谱 正相液相色谱 流动相极性小于固定相极性 分离机制：范德华作用力的定向作用力、诱导作用力及氢键作用力。氢键力是主要的作用力。 固定相：键合的氨基（－NH2)、腈基（－CN)、醚基（－O－）等 氢键力：氨基 腈基 芳硝基 二醇基 醚基 流动相：常使用烷烃为底剂，加入适当的极性调整剂。溶剂极性越大，洗脱能力越大。 适用范围： 不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体拆分和制备液相。 键合相色谱－正相色谱 氨基柱：极性强，具有碱性。 可在酸性水溶液中作弱阴离子交换剂，分离酚、羧酸、核苷酸等类物质。 与糖分子中的羟基作用，可分离单糖、二糖、多糖。 注意：氨基柱不能分析含有羰基的化合物（如醛、酮、还原糖等，流动相不能用丙酮） 键合相色谱－正相液相色谱 腈基柱：中等极性，分离选择性与硅胶类似，但保留值比硅胶低。 对酸性、碱性样品可获得对称峰。 对含双键的异构体或双键环状化合物有良好的分离能力。 芳硝基柱：弱极性 对芳香族化合物及多环芳烃有良好的分离选择性 键合相色谱－正相液相色谱 二醇基柱：弱极性 可分离有机酸及其共聚物。 也可以作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相 醚基柱：弱极性 可分离能形成氢键的化合物，如酚类和硝基化合物 也可以作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相 HPLC 的正相柱 硅胶基底 : 常用 氰基 : 常用 氨基 : 分析糖 二醇基柱 : 分析蛋白质 相互作用力是什么? 氢键力 如果样品有 -COOH : 羧基 -NH2 : 氨基 -OH : 羟基 氢键力变强. 如果样品没有任何官能团，如碳水化合物 如果样品有大的基团, 由于空间障碍 氢键力变弱. 正相模式下流动相的选择 主要试剂 烷烃 （戊烷、己烷、庚烷、辛烷） 芳香烃 （苯、甲苯、二甲苯） 二氯甲烷 氯仿 四氯化碳 辅助试剂 甲基-t-丁基醚(MTBE)，乙醚，四氢呋喃(THF)，二氧杂环乙烷， 嘧啶，乙酸乙酯，乙腈，丙酮，异丙醇，乙醇，甲醇 为了调整保留时间，可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂。 增加溶剂极性 键合相色谱－反相色谱 反相液相色谱 流动相极性大于固定相极性