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PCR技术 1. 直接从基因组中扩增 （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增 PCR反应体系 50ul： 　　10×buffer 5ul　　4种dNTP混合物 各200umol/L　　引物 各10～100pmol　　模板DNA 0.1～2ug　　Taq DNA聚合酶 1U 双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。 TGCATGCAT ATCTTGAAC TAGAACTTG ACGTACGTA TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ TAGAACTTG ACGTACGTA 95oC （1）DNA模板变性 模板 模板（template） 95oC TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ TAGAACTTG ACGTACGTA 3’ 人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。 （2）DNA模板与引物复性(退火） 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ 3’ ACGTACGTA 5’ 3’ 引物 引物 引物（primer）: 40-65oC DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。 （3）DNA链的延伸 TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ TAGAACTTG ACGTACGTA 3’ 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ ACGTACGTA 5’ Taq Taq 72oC 理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。 变性—复性（退火）—延伸。 （5）1个循环的结果 （4）新一轮循环开始 需要的模板量极低。 4. PCR的特点 （1）特异性强 ① PCR使用专门合成的DNA引物。 ② 延伸过程是在高温下进行。 （2）敏感性高 这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。 理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！ RT-PCR： 对模板的纯度要求低。 （5）可以扩增mRNA （4）简便 先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。 （3）快速 整个PCR过程约2-4小时即可完成。 不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。 PCR技术的应用 现代分子生态学 微生物生态学研究什么？ 1，有什么 2，做什么 3，能做什么 4，我们利用他们做什么 对环境中微生物种群的类型和数量进行及时和准确的分析测定在微生物生态研究中十分重要，传统的微生物分析测定方法，包括显微镜微生物形态观察、选择性培养基计数、纯种分离和生理生化鉴定等，在环境样品研究中都存在巨大缺陷。 近年来，人们运用微生物生物化学分类的一些生物标记，包括呼吸链泛醌、脂肪酸和核酸，来进行环境样品中的微生物种群分析。 其中，以16S rRNA／DNA为基础的分子生物学技术已成为普遍接受的方法，该技术主要利用不同微生物在16S核糖体RNA (rRNA)及其基因(rDNA)序列上的差异来进行微生物种类的鉴定和定量分析。 16S rDNA文库 有了微生物16S rDNA序列，不论是全长还是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析。Gen Bank将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类，但更为精确的微生物分类还取决于系统发育分析(phylogenetic analysis)。系统发育分析，就是根据能反映微生物亲缘关系的生物大分子(如16S rDNA 、ATP酶基因)的序列同源性，计算不同物种之间的遗传距离，然后采用聚类分析等方法，将微生物进行分类，并将结果用系统发育树(phylogenetic tree)表示。 变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE） DGGE的原理是：在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，DNA双链一旦解链，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降；因此，将PCR扩增得到的等长的DNA片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。每个条带代表一个特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的条带，一般可视为具有相同的DNA序列。 细菌PCR-DGGE结果 基因探针设计 虽然上述从核酸提取到PCR、克隆、测序和系统发育