总DNA的提取及PCR技术讲义【参考】.docVIP

实验三 植物总DNA的提取 原理 细胞中DNA主要存在于细胞核内，称为核DNA或染色体DNA，也有人称之为基因组DNA(genomic DNA)，严格地讲，基因组DNA是指单倍体细胞核DNA。细胞质中含有少量的DNA，称为核外DNA或核外基因。主要分布在线粒体及叶绿体内，分别称为线粒体DNA(mtDNA)及叶绿体DNA(ctDNA)。细胞内各种DNA总称为总DNA(total DNA)。 根据实验需要可分别提取不同的DNA。植物核DNA的提取主要用于基因文库构建、PCR分析及Southern杂交，也可以提取总DNA进行Southern杂交。核DNA分子呈极不对称的线状结构，一条染色体为一个DNA分子。高等植物核DNA的分子量为1012左右，约含有109bp，就其长度与直径的比例而言，是一个极不对称的分子。如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感，虽然现在已能够成功地测定出它的一级结构，但到目前为止，仍无法分离纯化出它的完整分子。在分离纯化过程中，DNA分子的降解是很难避免的。因而分离纯化所得到的只不过是植物核DNA分子的片段。采用不同的分离方法，所得的片段大小有所不同。用于Southern杂交的植物DNA样品在长度上应不小于50Kb。线粒体DNA及叶绿体DNA的分子要小得多，分子量约为107，而且为环状结构，因此完整的线粒体DNA及叶绿体DNA的分离并不十分困难，现已有许多报道。核DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA的提取一般是先分离出细胞核及细胞器，然后再提取DNA。总DNA的提取不必分离细胞核及细胞器，用温和的方法使细胞破碎后，核蛋白体自然释放出来。 方法概述 植物DNA的制备与动物DNA制备原理大致相同，为获得高质量DNA应选取幼嫩组织或组织培养物为材料，由于植物材料中DNase水平低，蛋白质含量较少，其操作要点主要是克服植物次生代谢物如多酚、类黄酮和植物多糖对DNA制备的影响。 关于植物总DNA的提取方法有关文献报道很多，但从提取原理上看主要有两种：CTAB法和SDS法。 CTAB法： CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)十六烷基三甲基溴化铵是一种阳离子≥0.7mol／L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3mol／L NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇随之被除去。 CTAB提取缓冲液的经典配方中各试剂的作用：CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；Tris-HCl (pH8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；NaCl 提供一个高盐环境，使CTAB与核酸形成的复合物充分溶解，存在于液相中；EDTA螯合Mg2+ 或Mn2+ 离子，抑制DNase活性；β- 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，PVP-K30（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离子化，使酚容易去除。操作的主要程序是植物材料冷冻研磨成粉后，加入高盐提取缓冲液，于56℃保温若干时间，使细胞破碎，核蛋白体解析，蛋白质变性。提取液中含有β- 巯基乙醇可防止材料中的多酚类物质氧化。然后用氯仿／异戊醇抽提，去除蛋白类物质。若一次抽提效果不理想，可补加少量高盐、高浓度CTAB溶液，继续用氯仿／异戊醇抽提。抽提后的水相，加入不含盐的CTAB沉淀缓冲液，降低溶液的盐浓度使核酸与CTAB形成的复合物沉淀，离心收集沉淀后再将沉淀溶于高盐溶液，然后根据后继实验对DNA纯度的要求，或者通过CsCl—EB密度梯度离心纯化，去除所有的蛋白质、多糖、RNA、寡核苷酸等不纯物，得到高纯度的DNA样品；或者向溶液中加入RNase，水解去除RNA，然后用氯仿抽提，最后用乙醇沉淀、经洗涤得到不十分纯的DNA样品。这两种处理所得的DNA样品均可直接用于限制性酶切及Southern杂交。只是样品纯度不同，杂交效果有所差异。 CTAB法提取DNA最初用于冷冻干燥的材料。其程序及试剂比例经适当调整也适用于新鲜植物组织及细胞器DNA的提取。用冷冻干燥材料提取时，使用1×CTAB提取缓冲液。用新鲜材料提取时使用2×CTAB提取缓冲液。实验需要注意的问题是CTAB溶液在15℃以下会发生沉淀，所以含CTAB的溶液不能在低温下离心。另外CTAB在氯仿溶液中有少量的溶解，因而在用氯仿抽提后须用含0.7mol／L NaCl、10％CTAB的溶液进行补充，以维持体系中的CTAB浓度在正确水平上。加入沉淀缓冲液后如果不发生沉淀，则表明盐浓度较高，可用沉淀缓冲液稀释。CTAB与核酸的复合物发生沉淀时，多糖、色素、多酚类化合物不应发生沉淀，所以得到的DNA沉淀应为白色或灰白色。有时提