PCR仪和凝胶成像系统解析.pptVIP

内 容 PCR的反应原理及反应体系 PCR示例 凝胶成像系统 ⑴94~96℃ 30’’-3’ 预变性（使模板充分变性） ⑵94℃ 30’’ 变性 ⑶45-65℃ 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） ⑷72℃ n’ 延伸 (按1’扩增1kb计算） ⑹72℃ 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） ⑺4-10℃ 保存 以PCR为基础的相关技术 逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 实时荧光定量PCR (quantitative PCR ) 多重PCR (multiplex PCR) 免疫PCR 差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR) PCR诱导定点突变 原位PCR (in situ PCR) 多重PCR技术的难点在于其多对引物的设计，必需保证多对引物之间不形成引物二聚体，引物与目标模板区域具有高度特异性 原位PCR(In situ PCR)原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR，对细胞中的靶DNA进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为直接法和间接法。基本步骤：组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原位PCR扩增→冲洗→产物检测优点：灵敏度高，可进行细胞内定位 差别PCR (differential PCR)差别PCR是将靶基因与已知拷贝的参照基因置于同一PCR反应体系中，用同一套引物进行扩增，电泳染色后可根据参照基因的扩增产物与待测基因扩增产物的相对丰度对待测基因进行定量。 ChampChemi Basic系列全自动化学发光/荧光/可见光成像分析系统 分析功能 可自动识别各种电泳图像条带，自动生成峰值曲线图，自动计算分子量、条带含量、百分比、IOD值、等电点等数据，并可进行PCR密度分析；分子量标准数据库可进行各种标准Marker的保存和调用，更可对双Marker电泳进行校正。 软件可对各种克隆计数、微孔板、抑菌圈、物体切片图像进行计算和分析。 所有数据、图像、图形均可导出至Excel 、Word 粘贴板、画图等软件或其它文件中。 EB染色应用于双Marker DNA琼脂糖凝胶电泳成像 SYBR Green荧光染料应用于DNA琼脂糖凝胶电泳的成像 考马斯亮蓝染色玉米种子蛋白质SDS电泳的凝胶成像 微孔板荧光成像 ECL发光底物检测小鼠BSA蛋白的蛋白免疫印迹（Western Blot）的成像 SuperSignal发光底物检测West Pico底物 克隆计数 抑菌圈成像和分析 昆虫的成像和测量 * 泸州医学院药理毒理研究室 * 仪器分析实验——分子生物学实验技术 药学院：刘明华 多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种在体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。 体内DNA的复制体系 DNA聚合酶（I II III） 拓扑异构酶 解旋酶类 SSB 引物 dNTP Mg2+ 5’ 3’ 模板 Mullis的PCR构思 引物 引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 模板 Mg2+ dNTP thermus aquaticus Taq DNA多聚酶的发现 1988年Saiki 等从温泉（?Hot?spring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process… Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 酶活性(%) 温度(℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 此酶的发现, 被PCR广泛应用。在?1989?年，Science?将PCR中的Taq DNA多聚酶命名为当年的风云分子? (Molecule?of?the?year) 酶量增加使反应特异性下降; 酶量过少影响反应产量。 反应体系中：浓度0.5-2.5 U/50 ?l 耐高温 Taq P1 P2 PCR反应体系 dATP dTTP dGTP dCTP Mg2+ 模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 辅助因子：Mg2+ 反应条件 PCR反应条件 7