在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和.docVIP

在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法 Komari 1996，McCormac等2001 。共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜安全hLF 、高赖氨酸 SB401 、高甲硫氨酸 RZ10 基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录。本文首次发现插入的外源基因间存在交换事件，从而改变了花培群体中无选择标记而目的基因阳性的转基因纯系的获得率。同时还对农杆菌介导的同一载体上多个基因转化水稻后，会出现个别基因丢失的情况进行了讨论。 群体因基因转化方法参照Hiei等 1994 的方法并加以修改。取开花后12-15 d左右的稻穗脱粒，表面灭菌后接种在NB培养基上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7d后取愈伤组织在相同条件下继代培养，用于共培养。农杆菌于含50mg/L卡那霉素 Kam 的YM平板上划线,28℃黑暗培养3d，用金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5，加入AS（终浓度为100mΜ）,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。将继代培养4d后的愈伤组织浸于此菌液中，20min后取出并用无菌滤纸吸去多余菌液，随即转入铺有无菌滤纸的固体培养基上，于26℃下暗培养2~3d。共培养后的愈伤组织在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，26℃暗培养14d，再转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14d。然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/l潮霉素的分化培养基上，暗培养3天后转至15h/d光照条件下培养,再生的小苗在1/2MS上生根壮苗两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，按编号移栽入土。 将双T载体p13HSR转化脆茎稻，共获得96株转基因苗（T0代）。PCR检测表明其中41株既含潮霉素抗性基因又含目的基因，42株只有潮霉素抗性基因没有目的基因，4株有目的基因没有潮霉素抗性基因，9株目的基因和潮霉素抗性基因都没有。双T-DNA区表达载体p13HSR在水稻中的共转化频率为42.7％。没有选择标记的13株（13.5％）T0代转基因苗，是逃过抗生素的抑制幸存下来的，从技术上和理论上都无法控制其出现频率，即使含有目的基因也没有实际操作价值。所以我们在实验中挑选了目的基因和选择标记都有的T0代植株进行后续的花培纯合实验。 从先期获得的6株T0植株中，检测出5株同时含选择标记基因和目的基因。将这些植株按单株进行花药培养，共获得花培苗233株，其中189株二倍体，7株四倍体，37株单倍体。二倍体植株的PCR检测结果表明，有68株既含潮霉素又含目的基因，24株只有潮霉素没有目的基因，74株目的基因和潮霉素都没有，23株有目的基因没有潮霉素。无选择标记而目的基因阳性的转基因纯合植株的总得率为9.87％，这些植株生长正常，株高、分蘖、穗长、单穗粒数等参数和对照相仿（资料未显示）。 RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录（图2，3）。以上结果表明，将遗传转化技术与花药培养相结合，快速获得了纯合的，同时含人乳铁蛋白 hLF 、高赖氨酸 SB401 、高甲硫氨酸 RZ10 基因但不含潮霉素抗性基因的二倍体转基因水