4实验四细胞中多糖和过氧化物酶研究.pptVIP

实验5 细胞中多糖和过氧化物酶的定位 实验目的 掌握显示细胞中多糖和过氧化物酶反应的原理和方法. 实验原理 一 过碘酸希夫氏反应（periodic acid schiff’s reaction，PAS反应）是1946年在Feulgen反应的基础上发展而来，是显示糖原的最经典、也是最直接的细胞化学方法。该反应首先由强氧化剂过碘酸将多糖中的乙二醇基（-CHOH-CHOH-）氧化成2个游离醛基 -CHO ，游离醛基与Schiiff’s试剂反应生成紫红色产物，颜色深浅与多糖含量成正比。 Schiff试剂 紫红色化合物 实验步骤 1、细胞中多糖的测定 （1）把马铃薯块茎用刀片徒手切成薄片，放入50mL小烧杯。 （2）浸入高碘酸5～15min， 1mL （3）吸去高碘酸，加入70％乙醇 2mL浸片刻， （4）吸去乙醇，加入Schiff‘s染色15min， 2-3mL， （5）吸去Schiff’s，用亚硫酸溶液洗3次，每次1min，1mL， （6）用蒸馏水洗片刻， （7）装片镜检。 实验步骤 1、细胞中多糖的测定 （1）把马铃薯块茎用刀片徒手切成薄片，放入50mL小烧杯。 （2）浸入高碘酸5～15min， 1mL （3）吸去高碘酸，加入70％乙醇 2mL浸片刻， （4）吸去乙醇，加入Schiff‘s染色15min， 2-3mL， （5）吸去Schiff’s，用亚硫酸溶液洗3次，每次1min，1mL， （6）用蒸馏水洗片刻， （7）装片镜检。 2、细胞中过氧化物酶的测定－联苯胺反应 （1）撕取洋葱内表皮1小块，平铺到载玻片上， （2）滴一滴0.1％钼酸铵溶液，作用5min。 （3）吸去钼酸铵溶液，滴一滴联苯胺溶液，待其出现蓝色。 （4）吸去联苯胺溶液，用0.85%盐水洗一次。 （5）盖上盖玻片，镜检。 细胞中存在的过氧化物酶能把许多多胺类氧化生产有色化合物，联苯胺可被细胞中的过氧化物酶氧化生成蓝色或棕色产物（蓝色物质为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可自然地转变为棕色的联苯胺腙），根据细胞中蓝色或棕色的出现显示细胞内过氧化物酶地分布。 实验原理 二 2 2 联苯胺 无色 联苯胺蓝 蓝色 联苯胺腙 棕色 -2H …… …… 2、细胞中过氧化物酶的测定－联苯胺反应 （1）撕取洋葱内表皮1小块，平铺到载玻片上， （2）滴一滴0.1％钼酸铵溶液，作用5min。 （3）吸去钼酸铵溶液，滴一滴联苯胺溶液，待其出现蓝色。 （4）吸去联苯胺溶液，用0.85%盐水洗一次。 （5）盖上盖玻片，镜检。 【注意事项】 掌握徒手切成技术，获得薄而均匀的切片，以便获得好的观察效果。 高碘酸处理的时间影响到染色程度，染色时间不宜过长。 联苯胺样品在与反应液作用时务必保证让溶液浸透样品。 染色时等见样品有蓝色出现时要再等1－2 min，以便能更清楚地观察。 联苯胺及其盐都是有毒的致癌物质，固体及蒸汽都很容易通过皮肤进入体内，引起接触性皮炎，刺激黏膜，损害肝和肾脏。实验中作为染液，在配制时在通风橱中进行，染色时用量很少，注意戴上手套，避免皮肤接触，若接触，应立即用肥皂水及清水彻底冲洗。 【作 业】 1.?观察、绘制PAS反应后细胞中多糖的分布情况。 2.?绘图表示过氧化物酶的分布。 3.?简述反应的原理。