PCR实验课-银屑 2011.docVIP

实验名称：PCR与基因分析实验 实验目的 掌握PCR实验的原理、方法、技术，并初步了解PCR技术在基因分析中的应用。 实验原理 PCR Polymerase chain reaction ——聚合酶链式反应，PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。其原理类似于DNA的体内复制，是在试管中给DNA的体外合成提供合适的条件，包括模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性和延伸的温度与时间等。 基本实验步骤 变性 将待扩增DNA模板加热，一般变性温度为95℃，双链DNA变性成为单链DNA。 退火 两条引物分别与两条DNA的两翼序列特异性结合——复性。退火温度（Tm）与引物序列的碱基组成、长度相关。 延伸 在适合的条件下，由Taq 或其他 DNA聚合酶催化引导DNA合成，即引物的延伸。延伸的温度一般是72℃，适合的条件包括： 这种热变性—复性—延伸的过程就是一个PCR循环。 试剂 引物——primer是与待扩增DNA片段两翼互补的寡核苷酸，其本质是ssDNA片段。根据待扩增片段的不同，所需引物亦不同，特异的引物限定了PCR扩增产物的大小。一般PCR反应中引物的终浓度为0.2~1μmol/L，在此范围内，PCR产物量基本相同。如果引物浓度低于0.2μmol/L，则产物量降低。如果引物浓度过高导致非特异产物合成，也会增加引物二聚体的形成。 耐热DNA聚合酶——HotStar Taq Plus DNA Polymerase：是一种经化学修饰的Taq DNA Polymerase，常温下没有聚合酶活性，避免PCR体系构建和循环初始阶段低温条件下非特异性引物的延伸和引物二聚体的形成。而酶活性的激活仅需要在95 ℃条件下孵育15 min，该条件可以整合入已有的PCR热循环程序。 缓冲液—— 10×PCR Buffer：给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应的pH值和离子强度。 Q-Solution：能有效扩增难扩增的模板，如二级结构复杂的模板和高GC含量的模板； MgCl2：Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的,Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外,也影响引物的退火, 模板与PCR产物的解链温度,产物的特异性引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时,酶活力明显降低;过高时,酶可催化非特异性扩增。 三磷酸脱氧核苷酸——dNTP：一般PCR反应中包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP四种三磷酸脱氧核苷酸，终浓度为20~200μmol/L。 模板——DNA/RNA：为含有目的序列的各种形式的DNA或RNA。在实验中，不仅需要待检对象的模板，同时需要做对照实验 ，包括阳性对照和阴性对照，前者一般指应用非相关的正常人模板，后者指在体系中不加模板，以便观察反应体系是否有污染。 PCR水：为去离子的双蒸水。 PCR反应条件选择——温度循环参数 变性温度与时间：只有有效的变性才能使PCR顺利进行。典型的变性条件是95℃30s-1min。在进行PCR循环之前，还需要进行预变性，一般为95℃5min。因为如不能使目的基因模板和/或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 复性温度与时间：合适的温度应低于扩增引物在PCR条件下真实Tm值的5℃。引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。复性时间不能太短，应大于30s，太长会增加非特异的复性。 延伸温度与时间：引物延伸温度一般为72℃（较复性温度高10℃左右）。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。72℃时，核苷酸的掺入率为35-100个核苷酸/s，这取决于缓冲体系、Ph、盐浓度和DNA模板的性质。延伸时间决定于目的序列的长度与浓度，时间过长会导致非特异扩增条带的出现。 循环数：循环数决定着扩增程度，一般在第25-35个循环过程中，扩增DNA量明显增加。循环数过多会增加非特异扩增产物的数量，太少PCR产物量就会太低。 HLA-Cw*0602检测——PCR技术应用 背景：银屑病（Psoriasis）是一种常见的炎症性皮肤病，其特征性皮损表现为覆有银白色鳞屑的红斑，是由角质细胞的异常增生以及炎症细胞向真皮和表皮的浸润导致的。皮损可累及皮肤任何部位，好发于头皮、躯干和四肢伸侧。 HLA-Cw*0602是已报道的银屑病易感基因 应用：用于检测个体是否携带银屑病易感基因HLA-Cw6。 方法：PCR扩增，电泳检测。 步骤： a 提取待检测者外周血DNA；溶解DNA，将其浓度稀释为50~100ng/ul。设立已知携带者对照（阳性对照），不携带者对照（阴性对照）和空白对照（体系中不加模板）。 b PCR反应试剂：10×PCR Buffer, Q-Solution, MgCl2, dNTP,