乳酸菌中抑菌物质的分离方法.docVIP

乳酸菌中有效抑菌物质的分离纯化方法（肽类物质） 1无菌浓缩乳酸菌发酵液的制备 将乳酸菌以1%接种量接种，置于37°C恒温培养箱静置培养36小时至乳酸菌生长达到稳定期后期，将发酵液以8000xg转速离心lOmin，取上清液置于-80℃冰箱中冷冻12h左右，用冷冻干燥机将发酵液冷冻干燥，根据浓缩倍数选择一定体积的浓度为lOmM的乙酸溶液将冻干后的固体重新溶解，将浓缩后的乳酸菌发酵液用无菌滤器过滤，得到无菌发酵液，备用。 2固相萃取 固相萃取柱的活化：将3mL甲醇，3mL去离子水，lmL浓度为100mM的乙酸溶液依次通过固相萃取柱，流速控制在5mL/min。 上样：将浓缩发酵液样品6mL加入固相萃取柱中，流速控制在5mL/min,抽干，收集样品。 水相洗脱：加入3mL去离子水，抽干，收集样品。 乙腈洗脱：加入3mL乙腈，抽干，收集样品。 3固相萃取小柱的选择和抑制真菌肽类物质的初步分离 将乳酸菌的无菌浓缩发酵液，用两种固相萃取小柱CLEAN-UP C18 封尾 和CLEAN-UP C18 未封尾 进行固相萃取实验，将发酵液的成分分为水相洗脱液，乙腈洗脱液和不能被萃取小柱吸附的透过液三部分，将这些样品分别进行高效液相色谱分离，高效液相色谱的条件为：使用戴安UltiMate3000高效液相色谱仪（电雾检测器），XBridge BEH300 C18分析柱 4.6x150mm ,流动相A液为水，B液为乙腈（含0.05%三氟乙酸），水相洗脱液，乙腈洗脱液进样体积100ul，洗脱吋间40min，流动相B液所占体积比从0升至90%。 4抑菌能力的生物检测 根据液相图像峰将液相分离出的物质置于真空浓缩仪中蒸干，蒸干后向每个EP管中加入50μl的无菌蒸馏水，溶解后将其转移到96孔板中，向每个孔中加入50μl的MRS培养基，以50μl的MRS培养基加50μl的无菌蒸馏水作为对照，向每个孔中再加入1μl的孢子数为106/mL的米曲霉I#。置于30℃的恒温培箱中培养2-3天，至长出霉菌营养菌体，用酶标仪测定每个样品的OD600。 5乳酸菌6-1-1的无菌浓缩发酵液中肽类物质的高效液相色谱制备及生物检测 将乳酸菌6-1-1的无菌浓缩发酵液，固相萃取小柱CLEAN-UP C18 未封尾） 进行固相萃取实验，将发酵液的成分分为水相洗脱液，乙腈洗脱液和不能被萃取 小柱吸附的透过液三部分，将这些样品分别进行高效液相色谱分离，高效液相色 谱的条件为：使用shimadzu LC-6AD半制备高效液相色谱仪，XBridge BEH300 Prep C18制备柱（19x150mm ，流动相A液为水，B液为乙腈（含0.05%三氟乙酸），进样体积lmL，洗脱时间40min，流动相B液所占体积比从0升至90%。生物检测方法见（4 ，每个样品设置2组平行。 参考文献： [1]钱洋.乳酸菌对食品中常见霉菌的抑制和黄曲霉素的去除[D].山东大学，2012. 发酵液抑菌物质的分离纯化与鉴定方法 一、抑菌物质的粗分 （1）发酵上清液盐析沉淀样制备 取菌株发酵上清液，用饱和度为80%的硫酸铵，4 ℃盐析沉淀 24 h，然后 4000 rpm，离心 20 min，收集沉淀，用蒸馏水将沉淀溶解。 将 MD44 DM-27 透析袋制成 15 cm 的小段，将透析袋放置于 2% NaHCO3和 1mmol/L pH8.0 EDTA 的沸水浴中煮 20 min，然后用蒸馏水或者去离子水浸泡透析袋，然后将其置入1mmol/L pH 8.0 EDTA 中煮 10 min，并在 4 ℃条件下贮藏备用。使用前用蒸馏水冲洗透析袋。10 mL硫酸铵盐析沉淀物水溶液在装有蒸馏水的容器中进行透析，透析工作温度为 4 ℃。15mL超滤离心杯，加入发酵上清液，进行二次离心。3000rmp 离心 20min，后调转速至3500 rmp，离心 20 min。先后用 10 KDa、3 KDa 超滤离心杯进行二次离心超滤，取截留液及10倍浓缩滤过液进行抑菌实验。利用离子色谱（D20 NEX ICS-3000）测定。色谱柱保护柱为 AG11-HC 柱 4mm*50mm ，分析柱为 AG11-HC 柱 4mm*250mm 。流动相 A 为 0.8—34 mM KOH。检测方法：流速为 1 mL/min，在 0—12 min，KOH 浓度为0.8 mM, 12—40 min，KOH 浓度为0.8 mM—34 mM 梯度洗脱，在 40—50min，KOH 浓度为 34 mM。柱温：30℃。乳酸、乙酸、酒石酸、草酸、柠檬酸标品购于中国药品生物制品检定所。将五种酸配成混标，备用。将第 4 部分进 GC-MS，仪器条件如下：色谱仪岛津（SHIMADZU）GCMS-QP2010-plus色谱柱：RTX-5MS 30m*0.25mm*0.25μm