(动物来源)碱性磷酸酶的提取及性质精选.pptVIP

（动物来源）碱性磷酸酶的提取及性质研究 主要内容 课题研究现状 研究方案 实验器材及试剂配置方法 课题研究现状 碱性磷酸酶(简称ALP或AKP) 是一种底物专一性较低的磷酸单酯酶，广泛存在于植物、动物和微生物体内，是一种重要的调控酶，在生物体内直接参与了磷酸基团的转移和代谢过程。 目前，国内外学者对 ALP 进行了广泛的研究，包括不同物种 ALP 的结构、催化反应机理、理化性质、分离纯化、功能基团、检测方法等。 课题研究现状 迄今为止，有大量关于碱性磷酸酶的报道，在1911年Levene等、1912年Grosser等就已经分离到(碱性)憐酸酯酶；直到1934年，Davis正式提出了碱性磷酸酶这一命名；1958年，Agren等运用同位素标记的方法分离到磷酸丝氨酸;近些年以来,很多研究者从不同动物组织中分离纯化出了碱性憐酸酶，并对其部分性质做了大量的研究。 研究方案 1.碱性磷酸酶的分离纯化 2.分子量测定（SDS—PAGE）原理 3.Km和Vmax值测定 4.酶的固定化 5.酶动力学研究 初步纯化原理 采取有机溶剂沉淀法从猪肝匀浆液中提取、分离碱性磷酸酶(AKP)。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有 AKP 的滤液，AKP 能溶于终浓度为 33％的丙酮或30％的乙醇中，而不溶于终浓度为50％的丙酮或 60％的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的 AKP。 分离纯化试剂 （1）0.5mol/L醋酸镁溶液：107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000ml （2）0.01mol/L醋酸镁-0.0lmol/L醋酸钠溶液:准确吸取20ml0.5mol/L醋酸镁溶100ml0.14mol/L醋酸钠溶液，混合后定容至1000ml （3）正丁醇、丙酮、乙醇 （4）Tris-HCl ph8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，即为0.1mol/LTris溶液.取100ml 10.1mol/LTris溶液，加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L醋酸镁溶液100ml，混匀后用1%冰醋酸调ph为8.8，用蒸馏水定容至1000ml； 碱性磷酸酶的分离纯化 ①取新鲜猪肝20g剪碎（0-4℃），加0.01mol/L醋酸镁—0.0lmol/L醋酸钠60ml，在电动匀浆机上匀浆，称为A液 ②除去杂蛋白 在A液中加10ml正丁醇，用玻璃棒搅拌3-5分钟后，室温放置20min—40min。四层纱布过滤后，离心30min，2500r/min，取上清液，放入干燥洁净离心管1 ③除去脂肪 在离心管1中加等体积的冷丙酮（-10℃）混匀，冰冻离心5分钟（2500转），弃去上清液，在沉淀中加0.5moL/l醋酸镁20ml，充分搅拌使其变成悬浊液，记录体积，称为B液 碱性磷酸酶的分离纯化 ④在B液中加95%的冷乙醇，使乙醇最终浓度达到30%，混匀后立即离心5min，量取上清液，倒入另一干燥洁净的刻度离心管2中，记录溶液体积，弃去沉淀。 ⑤在离心管2中加入冷95%的乙醇，使乙醇最终浓度达到60%，混匀后离心5min，弃去上清液，留下沉淀。 ⑥向沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁溶液10mL，充分溶解，向沉淀中逐滴加入冷丙酮至丙酮的最终浓度达到33%，离心5min，取上清液 ，放入干燥洁净的离心管3中 ⑦向3中加冷丙酮，直至丙酮的最终浓度为60%，混匀后离心5min，弃去上清液，留下沉淀，该沉淀即为部分纯化的碱性磷酸酶。向沉淀中加入PH8.8的Tris缓冲液10mL，使其溶解，称为C液。 分子量测定（SDS—PAGE）原理 SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。 电泳试剂 （1）分离胶缓冲液(A 液，3.0mol/L Tris－HCl 缓冲液， pH8.9)：1mol/L HCl 48mL，加Tris 36.3g，重蒸水定容至100mL，调至pH8.9 （2）30% 丙烯酰胺(B 液)： Acr(丙烯酰胺)30g，Bis(N，N－亚甲基双丙烯酰胺)0.8g， 加重蒸水定容到100mL （3）浓缩胶缓冲液(C 液，0.5mol/LTris