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[目的要求] 1. 掌握微丝的染色方法。 2. 了解光镜下微丝的基本形态结构。 3. 了解细胞松弛素B对微丝的作用及原理。 [实验原理] 当细胞用TritonX-100溶液处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮蓝（非特异性蛋白质染料）染色后，胞质背景着色弱，微管等蛋白结构在光镜下无法分辨，在光镜下观察到主要是由微丝组成的应力纤维。 应力纤维由平行排列的微丝组成，体外培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达，形态长而直，常与细胞长轴平行并贯穿细胞全长。 [实验用品] 器具：CO2恒温培养箱、倒置显微镜、超净工作台、低速离心机、普通光学显微镜、移液器、恒温箱、镊子、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸。 材料：盖玻片培养的成纤维细胞 试剂：6 mmol/L PBS（pH 6.5）、1％TritonX-100溶液、M-缓冲液、3％戊二醛固定液、0.2％考马斯亮蓝染液、100μg /ml的细胞松弛素B、DMEM培养液。 [实验步骤] 1. 培养 在成纤维细胞进行传代培养时，将已消毒的盖玻片涂上多聚赖氨酸，放入培养皿中，于37℃、5%CO2的温箱中生长24h～48h。 （设正常生长组和细胞松弛素B处理组） 2. 染色处理 （1）取材 取出铺有细胞的盖玻片，放入小培养皿中（正面向上）,用PBS洗3次（从盖玻片一角轻轻滴加3 ? 4滴），洗去表面的培养液。 （2）抽提 吸弃PBS，加入1% Triton X-100液4-5滴（刚好覆盖盖玻片表面），室温处理25 ～30min（或置37℃18min）。 [实验结果] 光镜观察，微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色，在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松弛素B处理的标本，由于微丝被破坏、突起缩回。多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚合成微丝，细胞形状恢复正常。 1．光镜下观察被染成蓝色的微丝聚集成的应力纤维束（注意成纤维细胞中微丝分布的特点）。 2．注意观察正常对照片与用药处理后的标本成纤维细胞形状的区别。 3．观察用药处理后又洗去药的标本中细胞形态是否恢复正常。 光学显微镜下微丝分布图 [注意事项] 1. 洗片时要轻柔，以免把细胞从载玻片上洗去。 2. 恢复时间要足够，否则细胞不会恢复到未处理 前的状态。 3．操作中应注意区分细胞盖玻片的正反面。 4．染色后应冲洗盖玻片背面，避免损伤细胞。 5．TritonX-100抽提蛋白时，注意避免抽提时间过 长而导致细胞结构的破坏。 [作业与思考题] 1．比较三种不同情况下细胞中微丝的分布特点？ 2．实验中设计对照组的作用及重要性？ 3．TritonX-100液、M-缓冲液、戊二醛及考马斯 亮蓝在本实验中所起作用？ * * 微丝染色及形态观察 真核细胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架，在维持细胞形状和运动方面具有重要作用。根据组成成分和组装结构的不同，可将细胞骨架分为微管、微丝和中间纤维。微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。微丝由蛋白单体聚合形成，细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。细胞松弛素B对微丝的作用具有可逆性。 微丝在细胞内的分布特征 （3）稳定 吸弃Triton X-100，立即用M-缓冲液轻 轻地洗涤3次，每次3min。 （4）固定 略晾干，在3%戊二醛液中固定10min， 再以PBS液洗3次，洗去固定液。 （5）染色 滴加3-5滴0.2%考马斯亮兰染液染色20 ? 30min，然后小心的用自来水漂洗。 （6）观察 留取少量水分封片于载玻片，吸水 纸吸去多余的水。光镜下观察临时装片。