电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用(精选).docVIP

电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用 电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用 Application of Electroporation in Gene Transfer and Animal Embryo Cloning 郝新保 范清宇 Hao Xin-bao Fan Qing-yu 第四军医大学全军骨肿瘤研究所 西安 710038 Institute of Orthopedic Oncology, Fourth Military Medical University, Xian 710038, China 摘 要 电穿孔技术利用电场造成细胞膜的改变从而将DNA导入细胞内，同时还可用于细胞融合以及动物克隆等。基因电转移的效率通常比化学法提高1-2个数量级，主要与脉冲波形、长度、缓冲液等有关。方波直流电脉冲应用广泛，在有关细胞核移植的多项研究报告中均指出其重要作用。关键词 基因转移，胚胎克隆，电穿孔 过去十年中，关于基因功能的研究取得了丰硕的成果，并因此带动了基因工程、基因治疗以及单克隆抗体技术的进步，而在动物生殖生物学领域的革命性技术进步则导致了绵羊、牛、猴子和小鼠等多种动物的克隆成功。电穿孔技术和仪器的发展在这些成就中扮演了重要角色，使得人类不但能从胚胎细胞克隆动物，甚至能从完全分化的成熟细胞获得克隆动物。全新的基因操作和生殖技术将为21世纪带来重要的科学成就。电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性，达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移，另一方面应用于细胞融合制备杂交细胞和动物克隆等。 1、 在基因转移和杂交瘤中的应用 1.1 动物和昆虫细胞转染电穿孔技术在80年代初期开始用来将DNA导入多种动物细胞[1]，较之传统的磷酸钙和脂质体转染，电穿孔具有操作简便、转染效率高等诸多优点，特别是对那些其它方法难以奏效的细胞具有明显优势，但它的影响因素也比较多。电场强度：电压太低时，细胞膜的改变不足以允许DNA分子通过，而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。对于大多数哺乳动物细胞细胞而言，250-2500V/cm的电压可获得有效转染[2,3]。电脉冲形状和长度：电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种，大多历时20-100毫秒。缓冲液：通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液，但有报道认为HEPES缓冲液的转染效率更高，血清也可以提高转染效率[4]。其它诸如转染温度，DNA浓度和构象等均会对转染效果产生影响。 1.2 大肠杆菌和酵母的转化电穿孔法在80年代末开始被用于转化大肠杆菌[5]，由于细菌相对较小，因此与DNA导入动物细胞相比，大肠杆菌通常要求4000-20000V/cm的脉冲强度才能获得有效转染。化学法感受态细胞的转染效率最高只能达到每微克DNA 106-108个转化体，而电穿孔法却可以达到109-1010个转化体的水平，较前者提高10-100倍，因此在制备cDNA文库等要求较高转化率的工作中就显得十分关键。 酵母菌电转化克服了乙酸锂和原生质体法烦琐和转化率低的不足，效率明显提高[6]。 1.3 细胞融合制备杂交瘤 细胞融合主要用于产生杂交瘤细胞[7,8]。在单克隆抗体的制备过程中，传统用PEG融合法产生杂交瘤细胞，这在现代化生产中存在许多局限性。而电融合法制备杂交瘤可以大规模地批量、高效融合，缩短了整个生产周期。除此以外，在细胞生物学研究中电融合还被广泛应用于其它杂交细胞的制备[9]。 2、胚胎工程的核移植和活化 在从简单的胚胎干细胞转染到核移植胚胎的电活化中，电穿孔技术都发挥了关键的作用，下面是一些重要的应用。 2.1 单性生殖、四倍体及嵌合体 2.1.1 单性生殖中的电活化 反复的直流方波脉冲可以激活卵母细胞使其发生分裂而产生单倍体胚胎。可以通过细胞松弛素B抑制第二极体或通过电融合来获得二倍体细胞。 2.1.2四倍体胚胎的制备 在胚胎的两细胞阶段应用直流脉冲可以导致细胞融合产生四倍体胚胎。这在小鼠和猪、牛都得到了应用[10]。 2.1.3 胚胎干细胞嵌合体的制备 通过胚胎干细胞的电转染可以制备嵌合体转基因小鼠。将干细胞注入受体的胚泡，然后将这个胚泡转入代理母亲子宫。出生的后代之间互相杂交产生纯合子可供用于生殖研究。已经制备了如小鼠、猪、兔和鳉的胚胎干细胞嵌合体[11]。 2.2 电融合在核移植技术中的应用 1938年当Hans Spemann提出核移植的设想时克隆技术已经初露端倪。首次在两栖类动物进行的克隆报道于1952年，但直到1970年青蛙才被克隆成功。核移植是目前多个物种生殖研究的热点技术。 核移植克隆的目的是将被克隆生物的细胞核转移到宿主系统中来指导胚胎的发育并产下新的个体。首先将针插入去核卵母细胞的透明带，把供体细胞注入