病毒TCID50测定(组织半数感染量.docVIP

一、实验目的 ??? 了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 二、测定病毒感染力的方法 半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测 半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测 蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测 三、材料 1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV） 四、TCID50的操作步骤 1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-10-10。 2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100μl。 3、在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2~3×105个/ml。 4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100μl生长液+100μl细胞悬液） 5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。 6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法 五、TCID50的计算方法 1、Reed-Muench两氏法 下用这个计算病毒的CID???????????2、Karber法 含义：将该病毒稀释103.875接种100μl可使50%的细胞发生病变。 操作步骤(1) 准备细胞 取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。(2) 稀释待测病毒液。A法为参考书上标准的操作方法B法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500μl，即10-1为50μl加入450μl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100μl加入900μl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。【切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。】37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200μl继续在37℃ CO2培养箱中培养。(4) 培养将培养板放置于CO2培养箱。培养温度???? ，培养??? 天。(5) 测定结果取出培养板，显微镜下观察细胞病变。 计算方法1) Spearman-Karber 法??? LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + d×∑R1/N1）??? ???? X0 = 全部病变最低稀释度对数???? d = 稀释因数对数???? N1 = 每个稀释度所种的孔数???? R1 = 病变孔数?????????????????????? ∑ = 积和 LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0.2ml +0.7 2) Reed-Muench法观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50