3血红蛋白的提取与分离介绍.ppt

(2)红细胞的洗涤 ①洗涤红细胞目的 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少 ②洗涤操作 A、采集血样 B、低速短时间离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果） C、吸取血浆：上层透明的黄色血浆 D、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤 E、低速离心（低速短时间） F、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净 (3)血红蛋白的释放 加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白 (4)分离血红蛋白溶液 ①过程 将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min 第1层（最上层）：甲苯层（无色透明） 第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体） 第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体） 第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色） ②试管中溶液层次 用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体 ③分离 取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时 (5)透析 除去样品中分子量较小的杂质 ①过程 ②透析目的 2、凝胶色谱 （1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平 ②底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底 注意事项： ⑤安装其他附属结构 ③顶塞的制作 打孔 安装玻璃管 ④组装 将上述三者按相应位置组装成一个整体 （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择 A、材料 “G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克 B、代表意义： 交联葡聚糖凝胶（G-75） 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液 ②凝胶的前处理 ③凝胶色谱柱的装填方法 A、固定 B、装填 将色谱柱处置固定在支架上 将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀 注意： 2、装填凝胶柱时不得气泡存在： 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙 * 2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成 这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代 人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息 蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究 (一）蛋白质 占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物 2、组成元素 C、H、O、N 一、基础知识 1、含量 3、相对分子质量 高分子化合物 4、基本组成单位 氨基酸 5、氨基酸通式 R H C COOH NH2 6、氨基酸连接方式 脱水缩合 8、分子结构 7、肽键 CO NH 氨基酸 肽链 蛋白质 脱水缩合 盘曲折叠 （一条或者多条） 10、生理功能 细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者 氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别 9、蛋白质结构的多样性 ①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个 ②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成n - m个肽键,脱去个n - m个水分子，至有氨基和 羧基各m个 11、相关计算 ③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构 ④关于蛋白质相对分子量的计算： n 个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为n ·a - (n - m) ·18 1、分离生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 2、 蛋白质分离和提取的原理 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质 (二）蛋白质的提取 3、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？ 变性、变性、空间结构 4、人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DN