4测序技术程序.ppt

基因与分子标记的共分离 共分离：位于特定基因附近的限制性标记，与突变表型密切相关，呈共分离现象。 比较患病者和正常人的DNA 限制图谱，发现一个特定的限制性位点通常出现(或者丢失)在患者DNA 中，限制性标记与表型间100%相关 表明：限制性标记与突变基因距离很紧，以至于它们在重组中不能分离 人类遗传图 人类基因组计划的最初目标---完成一份遗传图，其密度至少为每1000kb 一个标记 1994年完成，密度达到600kb一个标记 含有5264个微卫星序列 不久，一份物理图也随之问世，其密度为每100kb一个标记 含有7000个微卫星序列 遗传图的分辨率有限：基因组大，人类及大多数高等真核生物不可能获得大量的子代，最好的人类遗传图标记密度平均为599kb，不能指导基因组测序（100kb） 遗传图的精确性低：重组热点，染色体的某些位点之间比其他位点之间有更高的交换频率 物理图谱 限制酶作图 基于克隆的基因组作图 荧光原位杂交（FISH） 序列标记位点（STS) 人类基因组物理图 样品中仅存在较少的限制性位点/小分子量DNA分子，用常规的限制酶即可绘制物理图 稀有切点限制酶 限制性作图 稀有切点限制酶 特殊的凝胶电泳技术：脉冲凝胶电泳PFGE（电场方向不断变换） 啤酒酵母基因组 构建粘粒文库 建立克隆重叠群 完成测序 高等生物基因组 拟南芥120Mb，需要25000个克隆 人类基因组是拟南芥基因组的30倍 基于克隆的基因组作图 大容量的克隆载体 酵母人工染色体YAC 细菌人工染色体BAC P1人工染色体PAC 重叠群组建 重叠群contig：相互间存在重叠序列的一组克隆。 最早组建重叠群方法—染色体步移：从基因组文库中挑取一个指定的或随机的克隆，然后在文库中寻找与之重叠的第二个克隆。在此基础上再寻找第三个克隆，依次延伸 染色体步移的速度缓慢，仅适合于小基因组及小区段染色体的物理图绘制 指纹作图 指纹fingerprinting：DNA样品所具有的特定DNA片段组成，限定的序列特征。指纹重叠，表明2个克隆具有共同的区段 限制性带型指纹：用限制性酶处理样品，凝胶分析，DNA条带有部分相同，说明它们含有重叠的序列 重复序列DNA指纹：不同克隆酶解电泳，转移到杂交膜中，用一种或几种基因组范围的重复序列作为探针杂交，出现相同的杂交带型，说明重叠 重复序列DNA PCR：设计与重复序列互补的引物，对检测的克隆进行PCR扩增，相同的产物，说明重叠 STS目录作图：STS是已知的单一序列。设计引物，对大量的单个克隆进行PCR扩增 荧光标记原位杂交 FISH：与同位素杂交的原理相同，DNA荧光染料。荧光标记信号在显微镜下观测，直接显示探针与染色体杂交的位置 杂交技术的延伸，杂交靶子是完整的染色体，由杂交信号提供作图信息。将样品涂抹在载玻片上自然干燥，然后用甲酰胺处理使其变性。 中期染色体：主要用于确定新发现的分子标记属于哪条染色体，给出十分粗略的染色体定位 机械伸展的染色体：分离与制备中期细胞核，离心，获得伸展的染色体，长度增加20倍。 间期染色体：已获得基本的位置信息，极度松驰的染色体可用于小区段分子标记排序研究。 应用 定位DNA片段及嵌合体克隆验证； 确定染色体微小缺失与重复； 染色体断裂点分析； 间期细胞染色体数目异常诊断。 单拷贝探针 DNA片段的染色体定位 荧光原位杂交 染色体涂染探针 人类染色体结构分析 荧光原位杂交 多色复合染色体FISH探针 荧光原位杂交 序列标记位点（STS)作图 主流技术 限制性作图：快速，信息详细，但不适合大基因组。 重叠群构建程序复杂，费时费力。 指纹作图：对大基因组存在不少问题，如选用的限制酶不当或重复序列干扰，会出现误排。 原位杂交：操作困难，资料积累慢，一次实验定位的分子标记不超过3-4 个。 STS：sequence tagged site，一小段长度100-500bp的DNA序列，每个基因组仅一份拷贝，易分辨。 利用PCR/杂交分析所在STS位置，自动操作 表达序列标签EST：cDNA SSLP：具有多态性并已在连锁分析中定位 随机基因组序列：在数据库中寻找所感兴趣的某些序列 STS定位：定位在染色体或基因组中的DNA区段 克隆作图：基因组测序计划的准备工作之一，将基因组或分离的染色体打断，并将这些片段克隆到高容量的载体中，构建全基因组文库。 PCR方法检测含有标记的STS克隆，根据重叠的STS标记可绘制克隆连锁图 人类基因组物理图 1987年发表了第一份人类RFLP连锁图，含有393 RFLP和10个其他多态性标记，来自21个家庭，平均密度为10Mb 1996年遗传图 5