第14章基因重组和基因工程概念.ppt

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 目的要求 熟悉DNA重组的类型：同源重组、特异位点重组和转座重组等。 熟悉同源重组、特异位点重组、转座、插入序列和转座子、接合作用、转化作用和转导作用的概念；细菌的基因转移的方式。 掌握重组DNA技术的相关概念：重组DNA技术的基本原理和过程；目的基因的概念及种类。 熟悉限制性内切核酸酶的概念、识别位点及切割产生的末端；目的基因的获取途径；外源基因与载体的连接方式；重组DNA导入受体菌的方式；重组体的筛选方法。 什么是DNA重组？ DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合。 DNA重组广泛存在于各类生物： 真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。 原核生物来自不同亲代两组DNA之间可通过多种形式遗传重组。 同源重组最初的证据来自细胞遗传学对减数分裂时染色体行为的研究。真核生物在形成配子时，细胞染色体进行一次复制，细胞核进行两次分裂，由此从双倍体细胞产生单倍体细胞，故称减数分裂。 前期，参与联会的同源染色体实际上已复制形成两条姊妹染色体，从而出现有四条染色体构成的四联体。在四联体的某些位置非姊妹染色单体之间可以发生交换。 同源重组机制—Holliday模型 参与E.coli同源重组的主要酶 RecA蛋白：结合单链DNA，形成的复合物，复合物可将同源双螺旋中的互补顺序“退火”，同时将另一条链排挤出去，形成所谓D环 RecBCD：具有三种酶活性：①DNA解旋酶；②核酸外切酶；③单链内切酶的活性。 RuvC ：特异的识别Holliday分支点，并改变DNA在Holliday分支点处的构型，将两条单链切断，随后由连接酶将切口连接. ① 不需要特异DNA序列，而是依赖两个分子间序列的相同或相似性（同源性）； ② 同源双链DNA分子必须紧密接触，相对应方才能交换（联会） ③重组时，两个DNA片段必须有一个发生断裂或有一段单链缺失（空隙）。 细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移，并通过基因重组适应随时改变的环境。 这种遗传信息的流动不仅发生在种内，也发生在种间 如果被转移基因与内在基因部分同源就可以发生同源重组 F质粒DNA可以通过重组整合到受体的染色体中，使受体菌成为高频重组（Hrf)菌株 若F质粒的DNA未能完整地进入受体菌，则受体菌不能转化为F+ F质粒的DNA可以被切割出来，有时可携带宿主菌的染色体DNA，称作F?因子， F?因子携带的基因可在受体菌表达。 具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌称为感受态细胞 很多细菌在自然条件下就有吸收外源DNA的能力（如固氮菌、链球菌等），虽然感受态经常是瞬间的。 自然条件下感受态的形成需要10多种蛋白质参与 实验室：高浓度的Ca2+处理使细菌形成感受态 　 　 转导过程 （四）细胞融合 细胞质膜融合导致基因转移、重组 实验室：溶菌酶除细菌细胞壁，人工促使原生质体融合，引起广泛的重组。 如果一个DNA分子上两个特异位点之间发生重组，其后果有两种可能性：即两个位点之间的节段或被丢失，或被颠倒。 倘若基因重组发生在调节基因或基因调控区，就会影响某些基因的“开关”机制。有些生物能够利用这种重组倒置来控制基因的表达。 转座子中包含一些基因，这些基因可以使转座子从原来的DNA链位置上断裂开来，然后再插入到另外的DNA链位置上。当插入到一个新的位置后，转座子对附近基因的功能会造成一定的影响，在离开该位置时，它又有可能把一些附近的基因也一起带走。转座子的这种行为有点“唯我独尊”，是基因的自私性的一种表现。 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 （三）目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （一）目的基因的获取 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第22章)