if6.191BDE-47羟基化影响细胞外分泌与钙平衡增强了神经毒性的潜能.docVIP

摘要： 背景：氧化代谢引起了羟基化的多溴联苯代谢物形成，可能增强了溴化阻燃剂的神经毒性的潜能 目标：我们的目的是研究PBDE-47的羟基代谢产物对细胞内钙离子浓度和PC12细胞囊泡儿茶酚胺的释放的影响。 方法：我们用电流分析测定囊泡儿茶酚胺的释放和Fura一2测细胞内Ca2+浓度 结果：PC12细胞急性暴露于6-OH-BDE-47（5微摩尔）诱导囊泡儿茶酚胺释放，儿茶酚胺释放与短暂的细胞内Ca2+浓度增加一致，这个短暂的增加在暴露的一开始被观察到，一个另外的后期的细胞内Ca2+浓度增加常在≥1微摩6-OH-BDE-47被观察到。开始的短暂的增长暴露于母体化合物BDE-47时候没发生而后期的增长只在20微摩被观察到。用线粒体解偶联剂FCCP和毒胡萝卜内酯（TG）清空细胞内钙库，我们发短暂的增长起源于内质网的排空和结果导致细胞外钙离子内流，而后期的增长起源主要在线粒体。 结论：羟基代谢产物6-OH-BDE-47干扰Ca2+平衡和神经递质释放上比母体化合物更强力。本研究的发现说明氧化代谢引起的生物活化相当的增加了PBDEs的神经毒性。另外基于观察到的活动机制，PBDEs和邻位取代的多氯联苯对细胞内钙离子浓度累积的神经效应不能被排除。 前言： 溴化阻燃剂主要是PBDEs的浓聚物在环境，人类食物链，人体组织中的增加，提高了人群对可能的神经毒性的关注。高浓度的PBDEs和结构上相关的多氯联苯（PCBs）增加体外培养的神经元细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）。可能通过动员细胞内钙库的钙离子。这样的异生物质诱导的细胞内钙离子浓度增加特别受关注，因为这样的增加除了是生理病理过程所必须以外，也是囊泡释放神经递质（细胞外分泌）的关键。细胞内钙离子浓度的增长和细胞外分泌的发生之间的相互关系在神经细胞和神经内分泌细胞有广泛的研究，包括大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12。PBDEs的氧化代谢产物的证据在累积，但是羟基化的PBDE代谢物神经毒性的潜能和他们对钙平衡可能的影响还不知道。 在大多数生物样本中，PBDE-47是主要的PBDE同源物。初生暴露于这种PBDE的同源物引起神经行为的改变并且在小鼠海马切片降低长期的强化作用。对于暴露于PBDE-47的小鼠脑组织的分析显示突触后密度蛋白和激酶活性的改变可能对突触可塑性的降低起重要作用。BDE-47引起学习和记忆的受损并且降低海马切片长期强化作用的剂量被估计来导致脑浓度峰值大约为1微摩，而体外BDE的急性毒性影响只在3微摩至20微摩间被观察到 体外内分泌研究雌激素和甲状腺素受体系统的相互关系的结果指示，PBDEs羟基代谢产物比母体化合物更强力，最近的毒理研究确认了PBDE和羟基代谢产物间的转换。另外海洋海绵可以产生邻位的多溴二苯醚PBDEs。羟基代谢产物在野生动物和人类的血液中被检测到。因此，我们研究了6-OH-PBDE-47，一种环境相关的PBDE同源物PBDE-47的羟基代谢产物，对PC12细胞钙离子平衡和囊泡儿茶酚胺释放的影响，来对比其与其母体化合物的神经毒性的潜能。 材料方法：化学、细胞培养、数据分析和统计略 细胞活力检测：我们用细胞密度作为细胞活力的指示剂。暴露于DMSO或20微摩的6-OH-PBDE-47 20分钟后，细胞在新鲜培养基中培养24小时，换培养基后，洗去大多数死的分离的细胞，台盼蓝包含物，能将剩余细胞中的死细胞染色，我们测定细胞培养皿表面被活细胞所占的比例，每个实验条件测三个培养皿检测三次。 电流分析：用碳纤维微电极记录地塞米松分化型PC12细胞中钾诱发的和自发的囊泡儿茶酚胺释放的电流记录。一分钟作为基线记录，接下来用高钾溶液泼于PC12细胞上持续15秒来确定它们的应答性。细胞恢复两分钟，然后暴露于BDE-47和6-OH-PBDE-47 15分钟，这样来研究对囊泡儿茶酚胺释放的急性的影响。记录在室温完成。保证排除无响应或特别的细胞，我们测定了22个细胞基线释放频率。细胞显示一般的释放频率大于均数加两倍标准差被考虑为特别高释放频率。基于这些发现我们排除了细胞一般释放频率大于5个每分钟的。相似的，我们排除了诱发释放频率小于16个每分钟的，我们用20个细胞的结果做后期的数据分析。 细胞内钙离子成像：我们测定细胞内钙离子浓度的改变，用钙敏感荧光染料比例FURA-2（就叫FURA-2法）.简单来说，细胞在室温外部盐水条件下被5微摩的FURA-2AM 装载20分钟，然后在外盐条件下脱脂15分钟。然后在显微镜下，荧光在340和380的激发波长被诱发，每12秒记录一次，软件控制数码相机和多色器，也负责数据采集和处理，我们后期用定制的excel软件分析F340/F380的比值，反映细胞内钙离子浓度的改变。5分钟基线数据后，细胞暴露于0.2-20维摩的BDE-47或者6-OH-PBDE-47.最大和最小