生化101李丽霞18号作业.docVIP

实验题目：枯草芽孢杆菌的固体培养方案 实验：枯草芽孢杆菌具有广泛使用价值，通过培养基培养获得大批量的菌体芽孢，对工业生产具有很大的帮助。 实验器材： 主要设备：蒸气消毒器、超净工作台、控温摇床、控温生化培养箱、天平、显微镜、固体发酵罐， 实验药品： 液体种子培养基：葡萄糖0．2％，NaC1 0．5％，酵母膏0．5％，蛋白胨l％，pH 7．0。固体发酵培养基用原料及试剂：麸皮、稻壳、玉米粉、硫酸镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸锰 实验步骤： 方法 一： 液体种子培养 每300 mL三角瓶装量50 mL液体种子培养基，在l2l℃条件下灭菌30 min，降温后从斜面接一环菌苔至种子培养基，置37℃控温摇床培养， 转速220 r·min～，至芽孢率达90％以上时停止，约需24 h 2 三角瓶固体发酵培养 每500 mL三角瓶装量20 g，固体发酵培养基原料试剂混合料，加水，料水比为l：1．1，搅拌均匀，培养基经l2l℃灭菌30 min，降温后接种量为2％(V／M，V一液体菌种体积数，M一固体发酵培养基的质量，下同)，然后置37℃培养箱中静止培养，问时拍打，使其均匀生长。至脱落芽孢率80％以上时，停止发酵。然后于60℃烘干、粉碎、计活菌数 3 固体发酵罐发酵试验 在三角瓶固体发酵实验的基础上，结合大规模固体发酵的特点，在固体发酵罐中进行芽孢杆菌固体发酵配方的中试实验。第一步：以生产中的经验培养基(麸皮80％，稻壳20％，料水比为l：1．1)作为对照。操作如下： 培养基用蒸气灭菌，l2l℃灭菌20 rain，当料温降至50℃时，接入液体种子，接种量为10％(V／M)，搅拌均匀，进行发酵培养：整个发酵过程分两个阶段： 第一阶段(1～22 h)： l～10 h静止培养，物料缓慢升温；10 h以后间断通风（枯草芽孢菌是好氧菌）降温使物料温度控制在37℃，20 h左右第一次翻曲，并将温度控制在37℃ 第二阶段(23～40 h)： 在28 h左右进行第二次翻曲，将温度控制在35～37℃之间，直至发酵结束。发酵期间要定时取样镜检，当芽孢率达到80％以上时，停止发酵：60℃烘干、粉碎、计活菌数。 第二步： 按正交试验得出的最佳发酵培养基作为固体发酵罐发酵培养基进行发酵培养，操作方法同第一步。 4 检测方法 活菌计数：采用混匀平皿活菌计数法，按l0倍稀释法制成不同浓度稀释液，从3个合适的稀释液中分别吸取0．1 n I 置于无菌培养皿中，每一稀释度做 个平皿：将事先融化并冷却至50 c【：左有的同体培养基向每个培养皿中倒入约l2 mI ，摇匀，待凝同后，放入37℃培养箱中倒置培养24 h，进行菌落记数：芽孢率：采用芽孢革兰氏染色后显微镜下观察（枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，染色后显蓝紫色）。 计算： 二培养基选择与试验结果 1 培养基的选择 固体发酵的原料，以来源广泛的麸皮为主，在培养基配方中适当加入玉米粉，为了增加培养基的透气性，适量加入稻壳；加入豆粕作为氮源，但豆粕是一种迟效氮源，如添加少量速效氮源，可促进菌体的前期生长，故培养基配方中加入少量硫酸铵；由于硫酸镁、磷酸氢二钾参与微生物细胞壁的组成，硫酸锰有促进芽孢杆菌芽孢形成的作用，所以配方中加入硫酸镁、磷酸氢二钾和硫酸锰。因为所生产的产品为活菌制剂，所以最重要的控制指标是活菌数，而枯草芽孢杆菌只有形成芽孢才能有利于活菌保存，因而试验主要围绕活菌数和芽孢率这两项展开。另外，发酵周期也是一个很重要的试验指标，因为缩短发酵周期就意味着降低能耗，节约生产成本，增加生产批次 。 2 三角瓶正交试验 正交试验因素水平见表l： 从正交试验培养36 h后检测结果极差分析(见表2)可以看出，影响试验效果的主要因素排序为： 豆粕硫酸镁稻壳硫酸锰硫酸铵玉米粉磷酸氢二钾，最适培养基为麸皮80％，稻壳l0％，玉米粉5％ ，豆粕5％ ，硫酸镁0．05％ ，硫酸锰0．01％ ，料水比为1：1．1。添加硫酸铵并不能增加芽孢菌的活菌数，可见豆粕和麸皮不仅仅是氮源，而且其中含有许多活性物质对芽孢杆菌的生长有促 3 固体发酵罐发酵 发酵试验结果见表3。 ： 由表3可知，正交试验得出的最佳发酵培养基配方优于生产中的经验培养基配方，虽然它们的芽孢率一样，但发酵周期有所缩短，且活菌数达到304．3亿个·g～，提高了30％。 实验分析： 通过对枯草芽孢杆菌固体发酵培养基的优化试验，得到的培养基明显优于生产中的经验培养基，最佳培养基配方为麸皮80％，稻壳10％，玉米粉5％，豆粕5％，硫酸镁0．05％，硫酸锰0．0l％，料水比为1：1．1，活菌数最高达到460亿个·g～=且应用于固体发酵罐中发酵效果良好，在固体发酵罐中活菌数达到304亿个·g～。至于发酵过程中的其他条件(如通气量等)的控制，有待于进一步的试验研究。 由于同体发???的三角瓶小试和工