第十六章_细胞的破碎.pptVIP

第十六章—细胞破碎 (Cell Disruption);生化分离过程的一般流程;3.1 概述; 由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。;几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物; ; 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 ;;细胞壁的组成和结构（细菌肽聚糖结构示意图）; ☆阴性菌的肽聚糖层较薄，仅2～3nm，占细胞壁成分的10％左右,由于肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽聚糖居于细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上，在肽聚糖层外面还有一较厚的外壁层(约8～10nm)，主要成分为脂蛋白、脂多糖和其它脂类，因此，革兰氏阴性菌细胞壁中脂类含量较高。;酵母菌;;某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，常有三层组成。 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素（酚类组分的聚合物）的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。 ;植物细胞细胞壁的化学组成;组织捣碎匀浆机 ;3.3 细胞壁的破碎;(1)直接计数法 直接对适当稀释后的样品进行计数，可以通过平板计数技术或在血球细胞器上用显微镜观察来实现最终染色细胞的计数。 (2)间接计数法 间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量(例如可溶性蛋白、酶等)。 ;3.3.2 细胞破碎的方法;(一) 机械法; 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。 ;Netzsch LM-20型珠磨机;高速珠磨机工作原理;在珠磨法中，细胞的破碎率也能用一级速率方程式 表示： ln[1/(1-R)]=Kt K－破碎速率常数 t－停留时间 R－破碎率 破碎速率常数K与许多操作参数有关，如搅拌转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠的装置和珠体的直径以及温度等。; 1.进入珠磨机的细胞浓度和负荷，料液的流速，搅拌器的转速和构型，以及温度等。这些参数不仅影响破碎程度，也影响所需能量。 2. 珠体的大小应根据细胞大小和浓度以及在连续流动的操作过程中不使珠体带出来选择。 3. 珠体在磨室中的装量影响破碎程度和所需能量，破碎面包酵母菌适宜的珠体装量为80％，珠体量的增加使热扩散性能降低而引起温度升高。 4. 增加搅拌速度能提高破碎效率，但过高的速度反而会使破碎率降低，能量消耗增大，所以搅拌转速应适当。 ;②高压匀浆破碎法;操作原理:; 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母菌等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合公式： ln[1/(l－R)]＝KNPα 其中 R：破碎率； K：与温度有关的速度常数； P：操作压力； N：悬浮液通过匀浆器阀的次数。 a：与微生物种类有关的常数； ;高压匀浆法适用的范围;高压匀浆法使用时注意事项;高压匀浆器破碎细胞;③超声波破碎法;超声波破碎;;超声波破碎的机理;超声波破碎的适用范围;影响因素：; 超声波清洗器(DL-720D ) DL型系列超声波清洗器除其本身具有高效，高质量的清洗功能外，还具有“脱气”、“提取”、“乳化”、“加速溶解”、“粉碎”、“分散”等多种功能。产品广泛应用于各种需要清洗的物品。 ;机械法的缺点：;二、非机械法; ①酶解;;酶解法的优点 ;自溶作用 ; ②化学法 ;酸碱处理，调节pH，改变蛋白质所带电荷，物质间作用力降低，蛋白质溶解。;;化学法和酶法一样也存在对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故使用较多。但该法容易引起活性物质失活破坏，因此，根据生化物质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件是非常重要的。另外，化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。如表面活性剂存在常