常用分子生物学技术11-7new详解.ppt

南方医科大学基因工程研究所 生物化学与分子生物学教研室;一、分子杂交与印迹技术 二、PCR技术的原理与应用 三、核酸序列分析 四、基因文库 五、生物大分子相互作用研究技术 六、遗传修饰动物模型的建立和应用;第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular hybridization  blotting technology;核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。;实质是核酸分子的变性与复性过程;核酸分子杂交技术是依据DNA双链碱基互补、变性和复性原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列。;杂交;（一）印迹技术;带有放射性核素、生物素或荧光染料标记的，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 ;二、印迹技术的类别及应用;英国人Southern (1975)发明，将琼脂糖中的DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上进行DNA分子杂交分析的方法。 ;是经典的RNA分析法，用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。过程类似于Southern blotting。 ;Northern印迹分析原理示意图;;蛋白质水平上检测细胞或组织中特定基因的表达活性的最常用的方法（定性和半定量分析）。; 蛋白质样品的制备 SDS分离 蛋白质转膜 特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印迹杂交 再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig） 最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取免疫印迹信息;17;18;辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗可以使加入的化学发光底物发生氧化降解，发射波长为428nm的光，并可通过X光胶片感光记录下来。?? ;SDSpurified recombinant human CK2α(重组人酪蛋白激酶2α) subunit and its Western blotting;三种印迹技术的比较;放射自显影照片;其他： 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA芯片 (DNA chip);斑点印迹 (dot blotting);25;原位杂交（in situ hybridization，ISH）;小鼠大脑皮层mRNA原位杂交;;;DNA芯片;31;叠加图：绿色代表下调；红色代表上调 ；黄色无差异。;1. 芯片的制备 ;Sample cells; ;4. 检测分析;5. 图 像 处 理;6. 图 像 分 析;39;40;第 二 节 PCR技术的原理与应用;聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。;1971年，Khorana（美国MIT教授，1968年诺贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。” 核酸体外扩增最早设想被遗忘原因： （1）很难进行测序和合成寡核苷酸引物； （2）1970年Smith等发现了II型限制酶， 体外克隆基因已成为可能。;1976年，台籍科学家钱嘉韵（Alice Chien）从黄石国家公园的嗜热菌Thermus aquaticus中分离出热稳定的Taq DNA聚合酶。 1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis发明PCR反应，Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人?-珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。;;1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。 1989年被誉为的“分子年”，PCR为十大科技发明之首。 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。; patent sold by Cetus corp. to La Roche for $300 million depends on thermo-resistant DNA polymerase (e.g. Taq polymerase) and a thermal cycler;The Nobel Prize in Chemistry 1993