Western blot全过程.docVIP

Western blot全过程 1原理及目的： Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液。 9. 沸水浴中3分钟 。 10. 上样 。 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）。 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）。 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色。 14. Westernblot 试剂盒显色。 15. 分析比较记录。 Western具体实验步骤 1.收集蛋白样品（Protein sample preparation） 可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分）维持4℃。加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟。移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟。 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度。【具体方法】 2.电泳（Electrophoresis） （1） SDS凝胶配制 SDS凝胶可以参考一些文献资料进行配制，【配制方法根据分离的目的蛋白的分子量大小选择凝胶浓度】 （2） 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制， 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 （3）上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。【预染marker？】 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。 3.转膜（Transfer）【转膜缓冲液】 我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜（NC膜）也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。 通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 ?在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 4.封闭（Blocking）【western洗涤液】 【封闭液用什么，多大浓度？】 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注