第2章1生化实验中的缓冲液汇编.ppt

生化实验中的缓冲液 缓冲溶液的正确配制和pH值的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极为重要的意义，因为在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH值下进行的，而且受到[H+]的严格调控，能够做到这一点是因为生物体内有完善的天然缓冲系统。生物体内细胞的生长和活动需要一定的pH值，体内pH环境的任何改变都将引起与代谢有关的酸碱电离平衡移动，从而影响生物体内细胞的活性。 为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同的pH值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定，也必须选用合适的pH值，因此，在生物化学的各种研究工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种缓冲试剂的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，精确地测定溶液的pH值，就是非常重要的基础实验工作。 适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性： ① pKa值在6～8之间； ② 在水中的溶解度高； ③ 不易穿透生物膜； ④ 盐效应小； ⑤ 离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小； ⑥ 不与金属离子生成复合物或沉淀； ⑦ 该缓冲剂化学稳定； ⑧ 紫外和可见光波长范围内光吸收小； ⑨ 易制得高纯度的盐。 按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂来配制所需的缓冲溶液。 人体体液的pH值： 体 液 pH 体 液 pH 血 清 7.35～7.45? 大肠液 8.3～8.0 成人胃液 0.9～1.5 泪 6.6～6.9 唾 液 6.3～7.1 尿 4.8～7.5 胰 液 7.5～8.0 脑脊液 7.35～7.45 （一）磷酸盐缓冲液 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽： NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21 Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32 配酸性缓冲液： 用 NaH2PO4，pH＝1～4， 配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8， 配碱性缓冲液： 用 Na2HPO4，pH＝10～12。 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为： ①容易配制成各种浓度的缓冲液； ②适用的pH范围宽； ③pH受温度的影响小； ④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。 其缺点为： ①易与常见的钙Ca2+离子、镁Mg2+离子以及重金属离子缔合生成沉淀； ②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 应用： 1、PB缓冲液：Na2HPO4-NaH2PO4; 2、PBS缓冲液：Na2HPO4-KH2PO4 , NaCl+KCl (二) Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris (hydroxymethyl) aminomethane）缓冲液 　 Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。 Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围， 例如： Tris-HCl缓冲液： pH＝7.5～8.5 Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0～9.0 配制常用的缓冲液的方法有两种： ①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法； ②若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液：先称12.11g Tris碱溶于950mL～970mL 无离子水中，边搅拌边滴加4mol/L HCl，用pH计测定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水补足到1L。 Tris-HCl缓冲液的优点是： ①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液； ②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。 其缺点是： ①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1； ②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，即：△pKa／℃＝－0.031 ，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，则37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能