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Feulgen反应 原理介绍 自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一.Feulgen染色是经典显示去氧核糖核酸的方法,该法要求用Carnay氏液固定的新鲜组织效果最好,酒精-甲醛液次之,单纯甲醛固定欠佳,效果不满意.自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。 2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3 DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。 碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时被氧化，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色 利用1M HCl 、60下水解时，可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中。Feulgen反应步骤 标本需经固定后方可染色，Carnoy固定液可按无水乙醇：三氯甲烷：冰醋酸为6：3：1比例配制。固定后石蜡切片即可。尽量不用新鲜组织恒冷箱切片，因胞质中存在的缩醛磷脂会出现非特异染色。若必须使用恒冷箱切片，需做切片后固定。用已固定的组织石蜡切片可消除缩醛磷脂。减少非特异染色，具体操作如下： 1．切片脱蜡入水； 2．用lmol/L HCl浸洗； 3．切片放人预热到601mol/LHCi内6分钟，(固定的标本为10～15分钟．Susa固定的标本为18分钟，水解时间因固定液不同而有差异)； 4．入室温lmol/LHCl洗； 5．蒸馏水洗； 6．人Schiff液，于室温暗处(或外包黑纸)30～60分钟； 7．人亚硫酸钠水溶液漂洗3次，每次1～2分钟； 亚硫酸钠水溶液配法： 10%NaHS03??? 5ml 1mol/L HCl??? 5ml 加蒸馏水至??? 100ml 8．蒸馏水洗； 9．脱水、透明、封固。 结果：细胞核内DNA染成紫红色 对照实验： 虽然Feulgen法是DNA 的特异染色方法，但如果延长水解时间并在室温下进行反应， Schiff试剂也与醛、酮、醇和缩醛磷脂起反应，因此用Feulgen法检测DNA时必须严格控制盐酸水解的时间和温度。为减少假阳性和非特异性染色必须做对照实验。可按上述步骤做平行对照实验，仅将第3步，即60 lmol/LHCl水解改为室温15分钟，其余与上述步骤相同，结果DNA应为Feulgen阴性反应。 Feulgen反应图大鼠肾小体和肾小管细胞核呈nigert阳性反应，含紫红色反应产物 对照切片的制做 进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。 以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。 Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8