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实验三 苏丹Ⅲ染色法染小鼠肠系膜脂肪细胞 【实验目的】 熟悉脂肪显示技术，了解脂肪在脂肪细胞中的分布脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质，根据其性质可分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。脂溶性染料显示法即采用苏丹染料中的苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ或苏丹黑等溶于脂类使脂类显色的原理显示脂类，使用时，注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。 其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。脂溶性染料显示法即采用苏丹染料中的苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ或苏丹黑等溶于脂类使脂类显色的原理显示脂类，使用时，注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。的70%酒精饱和液或丙酮和70%酒精等量饱和液，可将脂肪染为橙红色。  吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管不断吸去液体以去除固定液。 用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作，再进行一次冲洗。 用苏丹Ⅲ染色30分钟。 吸去溢出染液，擦净盖玻片表面及周边，用显微镜观察。 【实验结果】 在显微镜下观察脂肪细胞的染色结果：经过实验染色后肠系膜处脂肪细胞可以明显观察到细胞被染成桔红色。如图一。 图一 脂肪细胞染色 【分析与讨论】  1.脂肪细胞里含有大量脂肪，脂肪被苏丹Ⅲ染成橘红色，因而使整个细胞呈现橘红色。 2.选取实验的肠系膜时，选择在血管附近的肠系膜，此处细胞含脂肪颗粒比较多，容易观察。但是有一些血管周围的脂肪细胞非常厚，肉眼可见呈白色。这样的地方是无法观察的，所以选材时还要注意材料的透明度。此次实验中共制了4张片，其中有两张选取的肠系膜脂肪细胞较厚，造成视野中脂肪细胞分层堆积，造成观察不便。图一中右图脂肪细胞就相对较多，影响观察。 3.染色过程中染料的水分很有可能蒸发，因此在染色过程中应不时向载玻片中滴加染料。 4.观察时把物镜由10倍转向40倍时，应考虑物镜变长，要注意不要让镜面蹭到小鼠的小肠。 5.若观察时发现血管呈红色，是由于放血时没有放干净，下次实验时应该注意。 【拓展】 石蜡切片的制备 （一）石蜡切片前的准备 　1．切片刀。传统的切片刀在使用之前，一定要在显微镜下检查刀口的损伤程度，然后进行磨刀。现在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。 2．修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，两边必须平行。 3．蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。 4．载玻片擦洗干净后，在其表面涂上粘附剂（蛋白甘油、APES或多聚赖氨酸），根据染色方法选择不同的粘附剂。 5．准备好毛笔、镊子、染色架。 6．调好展片器内水的温度（45℃），有时也可以加些酒精到水中。（二）石蜡切片1．将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角。 2．切片多使用轮转式切片机，切片时，左手执毛笔，右手转切片机转轮，先修出组织块。 3．调整切片机上的切片厚度为4~7μm，然后切片。 4.切片可以是单张，也可以是连续切片形成蜡带。 5．展片和捞片： （1）直接展片法：在载玻片上滴加几滴蒸馏水，然后把切片铺在小滴上面，用酒精灯在载玻片下面加热，待完全展平，倾斜载玻片，倒弃多余水分，同时摆正切片。 （2）温水漂浮法：此法用展片机或者用恒温水浴箱，先使水温保持在45~50℃，用左手拿毛笔轻轻托起切片，用右手用眼科镊子夹起切片的一角，正面向上轻轻平铺放置于展片器的水面上，动作要轻快，切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作用会自然平整地展开，必要时可用眼科镊轻轻拔开，然后捞片，并及时编号。 6．展好的切片在室温下稍微干燥后，放在40℃恒温烤箱中，小片组织30分钟即可，大的需12~24小时，烤干备用。 注意事项 1．切片刀刃倾斜过大或过小都不能正常进行切片。 2．修整蜡块时要细心，看清楚组织在蜡块中的位置，以免将需要的组织修掉。 3．连续转动切片机的转轮时，速度一定要均匀，不能时快时慢，以免切片厚薄不一。 4．使用轮转式切片机切片时，是由下向上切，为得到定然整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬、脆难切的部分放在上端，如皮肤应将表皮部分向上，肠胃等组织应将浆膜面面朝上。 5．用展片器展片时，水温应根据使用的石蜡熔点进行了调整，一般低于石蜡熔点10~15℃；捞片的时候动作要轻、稍快。动作太大容易出现气泡。如果没有展片器可以用温水浴锅来代替。 6．单个切片要摆到载玻片的1/3与2/3交界处