第四章 HPLC.pptVIP

对HPLC柱的了解（六） 硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为：k 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 是选择性差异的主要来源 硅胶的杂质含量 重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志 * 对HPLC柱的了解（七） 填料的稳定性 硅胶填料 pH：2-8 聚合物填料 pH：2-12 pH值小于2时键合相水解 * 新一代硅胶基质的色谱柱 Symmetry 高纯度硅胶：Fe，Al，Mg等均10ppm 孔径100A，5m球形颗粒，端基封口 超高含碳量：C18/19%，C8/12% 表面积：300 m2/g 孔体积：1mL/g 特点 好峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长 * Waters聚合物基质的反相柱 特殊设计的多孔聚合物胶 有很宽的 pH 适应范围（2-12） 可用离子抑制方法分析碱性化合物 有非常不同的选择性 柱效及韧性比相应的硅胶柱低 色谱机理不太清楚 文献背景低，用户少 * 色谱柱的规格 内径 检测的灵敏度 样品的容量 长度 分离度，理论塔板数 速度 样品的容量 检测的灵敏度 * 色谱柱的清洗 对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗 硅胶柱的一般方法 先用甲醇洗去极性杂质 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化 键合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 * 3. 流动相及样品的预处理 液相色谱对流动相的要求 除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶ 与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 细菌的生长 * 流动相的脱气 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化 * 流动相脱气的方法 加热 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化 抽真空 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波 简单，但效果不理想。 通惰性气体（一般用氦气） 可保持连续脱气，多用于低压梯度 脱气机 可保持连续脱气，多用于低压梯度 * 样品的预处理 样品预处理的目的 除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于色谱柱及仪器的保护 * 样品的预处理重要性 占样品分析时间的比例 样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间 占分析的消耗总成本最大 消耗大量的溶剂及其他化学品 实验的重复性及准确性最差的环节 影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤 * 样品预处理常用的方法 高速离心 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-固萃取 / 液-液萃取 Sep-Pak样品处理小柱 其他 * 样品预处理的过程 * 去除微粒 过滤 过滤膜/过滤装置 有机(0.5m)/无机(0.45m) 膜片可更换 一次性使用的膜“Cartridge” 使用方便简单，交叉污染小 有更小内径，可用于微量样品的处理 高速离心 大于：10,000g * 超滤 机理 超滤是一种基于分子量分离的技术 目的 根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份 除去小分子样品中的大分子蛋白 脱盐 * 选择性沉淀 常用于生化样品中除蛋白 有机溶剂 乙腈，甲醇 强酸 三氯乙酸，过氯酸 盐 50% 硫酸铵 10% TCA * 样品衍生 提高检测的灵敏度 增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器 改变分离的选择性 改变组份的基团，如： 变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离 典型的例子 氨基酸分析 * 样品衍生∶氨基酸分析 * AccQ-Tag 衍生法 * 浓缩样品 浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 液固抽提/Sep-Pak小柱 * 固相萃取（SPE）技术 固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份 固相萃取技术（SPE）的重要性 实验室中60~80%的成本及工作量在样品制备上 加速样品的制备时间 降低样品前处理的成本 提高分析的准确性及回收率 更容易自动化 减少样品处理步骤 降低对不稳定样品的影响 提高安全性 * Waters的Sep-Pak小柱 Waters专门开发了固相萃取技术（SPE） Sep-Pak小柱的应用领域 除去杂质及干扰组份 把样品分成不同极性的组分析 富集微量的组份 Sep-Pak小柱的主要种类 反相 正相 离子交换 * Sep-Pak的种类 根据Sep-Pak及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分开 让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，或不与固定相作用 让所感兴趣的样品通过小柱，杂质留在柱上 让杂质留在柱上，所感兴